Séparation et quantification des classes de phospholipides en fonction du type de « tête » par une CCM 2D

Cette analyse biochimique a été développée par Bodennec et al [97] selon les étapes suivantes :

1.Extraction du matériel lipidique des tissus:

Afin d’extraire les lipides totaux du liquide synovial nous avons utilisé la méthode mise au point par Folch et al [75]. Cette méthode est réalisée en présence du « Folch 2 / 1 » mélange de chloroforme / méthanol (2:1, v/v). Ce mélange permet l'extraction homogène, à température du laboratoire, de la plupart des composés lipidiques présents dans le liquide synovial.

Les échantillons sont broyés dans 40 ml de chloroforme / méthanol (2:1, v/v) avec un broyeur type Polytron équipé d'un barreau Inox (modèle PT OD 10). Le barreau est rincé entre chaque opération par 10 ml de chloroforme / méthanol (2:1, v/v), il est ajouté ensuite au broyat précédent.

Les échantillons sont ensuite mis à -20°C pendant 24 heures pour assurer une bonne extraction du matériel lipidique, les échantillons sont ensuite filtrés sur papier par 10 ml de chloroforme / méthanol (2:1, v/v).

2.Purification de l'extrait lipidique:

Les contaminants hydrosolubles non lipidiques éventuellement entraînés avec le chloroforme / méthanol (2:1, v/v) sont éliminés par 2 lavages successifs:

a. Première purification:

Elle est réalisée par addition d'une solution aqueuse de KCl à 0,25 % (m/v), à raison de 1/4 du volume total de filtrat. Après agitation, deux phases distinctes se forment :

*Une phase inférieure, chloroformique, contenant les lipides

*Une phase supérieure contenant l'eau, le méthanol et les contaminants hydrosolubles. Cette dernière est éliminée par aspiration à la trompe à vide.

b. Deuxième purification:

Les proportions du Folch (2:1, v/v) sont d'abord restaurées par addition de méthanol absolu (1/3 du volume de Folch initial) à la phase chloroformique restante. Le second lavage est alors effectué avec de l'eau désionisée, dans les mêmes proportions que le premier. La phase supérieure étant éliminée après agitation par aspiration à la trompe à vide.

3. Détermination du poids de lipides totaux:

La phase lipidique lavée est transférée dans des ballons de 250 ml préalablement tarés et les solvants éliminés (évaporation au Rotavapor Buchi à 60°C, sous vide d'eau obtenu par trompe

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laminaire). Une deuxième évaporation avec 10 ml d'éthanol absolu permet l'élimination de l'eau résiduelle.

La déshydratation est achevée à température ambiante sous vide plus poussé (produit par une cloche à vide). La quantité totale des lipides purifiés est finalement déterminée par pesée, après équilibrage thermique.

Les lipides sont ensuite suspendus dans un volume déterminé de benzène/méthanol (1 :1 v/v) afin d’assurer leur conservation au congélateur. Ce solvant permet une bonne conservation des lipides pendant de longues périodes. La manipulation est effectuée sous hotte compte tenu de la toxicité propre au Benzène.

4.Dosage du phosphore lipidique total

Cette méthode, mise au point par (Fisk et Subbarow, 1925), a été modifiée par (Brichon G, 1984). Elle comprend deux étapes comme décrit ci-dessous :

a. la libération du phosphore lié aux lipides, par minéralisation acide. b. le dosage proprement dit du phosphore minéral.

a. Minéralisation :

Le phosphore lipidique est libéré par chauffage en présence de 0,25 ml du mélange suivant : * Acide sulfurique: 2 vols

* Acide Perchlorique: 1 vol

* Tétroxyde de vanadium (catalyseur): 1g/L de mélange

L'opération est effectuée sous hotte, par chauffage pendant environ 20 secondes sur bec bunsen, jusqu'à apparition de fumées blanches abondantes.

La même procédure est réalisée pour la gamme étalon contenant 0; 1,5 ; 3; 6 et 9 μg de Phosphore (solution standard de phosphate monopotassique à 6μg de P/50μl)

b. Dosage du phosphore:

Il est effectué sur les échantillons minéralisés par ajout de 5 ml dans chaque tube de réactif ANSA. Ce réactif est composé de :

x Mélange ANSA : (0,63 g),

x Heptamolybdate d'ammonium : (0,2 g) x H2O : 100 ml.

Le mélange ANSA est obtenu en homogénéisant à l’aide d’un mortier: x 60 g de métabisulfite de sodium.

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x 2 g de sulfite de sodium.

x 1 g d'acide amino naphtol sulfonique.

Sous forme de poudre il se conserve plusieurs semaines au sec et à l'abri de la lumière. Après addition de la solution et agitation au vortex, la réaction colorée se développe après 8 min de chauffage à 100°C au bain marie. L'intensité de la coloration (bleu de molybdène) est mesurée au spectrophotomètre à 830 nm directement sur les échantillons de lipides totaux.

5.Chromatographie sur couche mince en deux dimensions

Les plaques de chromatographie sur couche mince (CCM) en gel de silice G60 sans indicateur de fluorescence proviennent de chez Merck (Darmstadt, Allemagne).

Les différents phospholipides sont séparés par CCM 2D [97]. Pour cela, un aliquote de lipides totaux, correspondant à 15μg de phosphore lipidique est déposé sur une plaque de CCM en gel de silice dans le coin inférieur gauche de la plaque à environ 1,5cm du bord.

Une première migration est faite dans de l’éther diisopropylique jusqu’à fond de plaque afin de séparer les lipides neutres (triglycérides, stérols, esters de stérols,…) des lipides polaires (phospholipides, glycolipides,…).

Puis, la plaque est séchée et une migration est effectuée perpendiculairement au premier solvant dans un autre système de solvant (Tétrahydrofurane/Acétone/Méthanol/H2O 50 :20 :40 :6 v/v/v/v).

Apres séchage, une troisième migration est réalisée dans du Chloroforme/Acétone/Méthanol/Acide acétique/Eau (50 :20 :10 :15 :5 v : v : v : v : v).

Après cette dernière migration, la plaque est séchée et révélée par pulvérisation de réactif de Dittmer et Lester qui permet de visualiser l’ensemble des phospholipides (Dittmer and Lester, 1964) (figure 96).

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Le gel de silice correspondant pour chaque phospholipide est alors gratté et les étapes précédemment effectuées pour le dosage du phosphore lipidique sont répétées.

a. Minéralisation :

L'opération est effectuée sous hotte, par chauffage pendant environ 20 secondes sur bec bunsen, jusqu'à apparition de fumées blanches abondantes en présence de 0,25 ml du mélange suivant :

* Acide sulfurique: 2 vols * Acide Perchlorique: 1 vol

* Tétroxyde de vanadium (catalyseur): 1g/L de mélange

b. Dosage du phosphore:

Il est effectué sur les échantillons minéralisés, par ajout de 5 ml dans chaque tube de réactif ANSA. Après addition de la solution et agitation au vortex, la réaction colorée se développe après 8 min de chauffage à 100°C au bain marie. L'intensité de la coloration (bleu de molybdène) est mesurée au spectrophotomètre à 830 nm, après élimination du gel par centrifugation à1500 rpm pendant 15 min.

6. Expression des résultats

Les teneurs en Phosphore lipidique (P.lip) sont données en μg de P.lip pour 100 mg de protéines. Elles serviront pour le calcul des quantités de phospholipides totaux (PL) en utilisant la relation:

PL totaux = Phosphore lipidique total * 25

Les profils de répartition des phospholipides correspondent aux proportions relatives des divers phosphatides d'un échantillon, en pourcentage du phosphore lipidique total déposé. Les valeurs sont obtenues en rapportant les Densités Optiques (DO) individuelles corrigées de chaque phospholipide à la somme des DO totales corrigées. Les DO corrigées (DOc) pour chaque phospholipide sont obtenues selon la formule:

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