Choix des corps en contact (1 er corps)

Pour visualiser in situ le contact lors des essais tribologiques (frottement) nous permettant l’étude du comportement tribologique du volume de lubrifiant et des interfaces lipidiques, nous avons utilisé deux types de premiers corps :

A. un matériau modèle ex vivo pour le cartilage articulaire ; B. une contre face en verre transparent

A. Modèle ex vivo pour le cartilage articulaire

Comme nous l’avons déjà indiqué dans le chapitre I, pour simuler les propriétés mécaniques du cartilage articulaire, nous avons choisi un hydrogel HEMA sous forme d’ébauches des lentilles cornéennes (Bausch et Lomb Industrie).

Comme ces lentilles ont les caractéristiques du cartilage (module d’élasticité, porosité, hydrophilie) juste dans l’état hydraté, ces lentilles ont été hydratée 48h avant chaque utilisation dans les essais tribologiques dans une solution tampon pH 7.4 [78].

La rugosité de la surface frottante de la lentille HEMA est de quelques nanomètres RMS. [8]

B. Verre borosilicaté

Pour pouvoir visualiser in situ le contact pendant les essais de frottement, nous avons utilisé un verre contre face en verre borosilicaté de très faible rugosité (rugosité pic à pic de 1nm maximum).

Avant leur utilisation dans les essais tribologiques, les verres ont été immergés 2 fois dans un mélange d’eau ultra pure et détergent (Microson, Fischer-Bioblock, France) pendant 20 min à ultrason à 60^°C et ensuite rincés pendant 5 minutes à l’eau ultra-pure [67] , afin d’éviter les dérives du coefficient de frottement dues à une accommodation du glissement dans les complexes créés par des impuretés présentes sur leurs surfaces frottantes.

114 5.2.2. Choix du lubrifiant (3^eme corps)

Comme nous l’avons déjà présenté dans le chapitre I, en rapport avec les objectifs de cette thèse, pour le 3^ème corps nous avons choisi de tester différents types de liquides synoviaux (synthétique, en cultures cellulaires ou en prélèvements) afin de comprendre le rôle tribologique des assemblages moléculaires volumiques et le rôle des multicouches lipidiques qui forment l’interface LS / cartilage. Pour ce faire, le volume de liquide synovial a été testé en présence ou en l’absence de bicouches phospholipidiques supportées par les surfaces de HEMA et verre.

Afin d’élaborer les bicouches lipidiques nous avons dû choisir le type de phospholipide et la technique de fabrication des bicouches. Comme les principaux phospholipides dans les articulations saines sont en phase fluide [67] nous avons choisi le DLPC (1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine, Ref : 850335C, Avanti Polar Lipids) ) (figure 52 A) qui est aussi en phase fluide et mime bien le comportement tribologique des interfaces lipidiques du cartilage [67]. Concernant la technique nous avons choisi de déposer de bicouches lipidiques de DLPC en présence du Ca⁺⁺ (ayant pour rôle d’accrocher les lipides sur la surface hydrophile de verre et HEMA) par la méthode d’éclatement des vésicules lipidiques [146,147] sur la lentille HEMA et sur la contre face en verre qui permet la visualisation.

Figure 52. Structure chimique et vue 3D de molécules de DLPC (A) et NBD-PC (B) (source Avanti Polar Lipids)

La technique du dépôt, schématisée dans la figure 53 consiste à :

- incuber (5 mn) les surfaces frottantes dans la suspension diluée de petits vésicules lipidiques. Au cours de l’incubation, 2mM d'ions Ca++ sont ajoutés pour que les vésicules puissent s’accrocher et éclater à la surface (figure 53a).

- éliminer le surplus lipidique par rinçage, ce qui conduit à l’obtention d’une bicouche lipidique sur la surface frottante (figure 53b).

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Les ions Ca⁺⁺ ont pour rôle de rigidifier la bicouche en formant des liaisons ioniques entre les parties négatives (phosphates) des têtes lipidiques (figure 53c) [51].

Figure 53. Dépôt des bicouches lipidiques par la méthode d’éclatement de vésicules lipidiques a) adsorption des vésicules lipidiques sur la surface de la lentille HEMA, b) après éclatement des vésicules et formation de bicouches, rinçage et élimination du surplus lipidique, c) détail

de la structure interne d’une couche lipidique [8]

Les bicouches lipidiques que nous avons déposées sur les surfaces sont fluorescentes en lumière bleue, elles contiennent 1% de lipides NBD-PC (1-myristoyl-2-{6-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine) (810122, Avanti Polar Lipids), avec une partie fluorescente (NBD) liée chimiquement à l’une des queues lipidiques (figure 52B). Lorsque ce lipide est excité par une lumière bleue (465 nm), cette excitation lui fait émettre une lumière verte (535 nm).

L’intégrité de la bicouche lipidique (figure 54) a été visualisée en employant la microscopie optique de fluorescence : les zones plus claires correspondent à des détails plus fluorescents, par rapport aux zones sombres qui émettre moins de fluorescence, tandis que le contour octogonal noir correspond au contour du diaphragme de champ du microscope sur la surface transparente. Ainsi plusieurs situations peuvent se présenter :

- si la surface analysée ne contient pas d'éléments fluorescents en lumière bleue, le diaphragme n'apparaît pas dans l'image. C’est par exemple le cas d’une surface de verre sans bicouche lipidique (figure 54a) ;

- si la surface analysée contient des éléments fluorescents, les images obtenues en lumière bleue sont constituées d'une zone claire limitée par l'octogone du diaphragme. Cette zone claire peut être uniforme, comme dans le cas d’une surface de verre avec

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bicouche lipidique intacte (figure 54b) ou révéler des détails, comme dans le cas d'une bicouche non homogène présentant des vésicules lipidiques de quelques dizaines de micromètres (figure 54c). Les bicouches non homogènes ont été exclues des études tribologiques de cette thèse.

Figure 54. Etudes par microscopie optique de fluorescence – exemple d’images pouvant être obtenues suite au dépôt de bicouches phospholipidiques sur les surfaces des 1^ers corps, ici le

verre : a) surface de verre sans dépôt lipidique, b) surface de verre recouverte de bicouche lipidique homogène,

c) cas d’une bicouche lipidique non homogène avec des vésicules non éclatés.

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