rETR = ΔF/Fm’ x 0.5 x PAR
B) Séparation des phases et traitement des échantillons
La séparation des tissus animaux et des symbiotes s’effectue de la même manière qu’énoncé précédemment. Après avoir centrifugé les échantillons, le surnageant, contenant le tissu animal est récupéré dans un tube Falcon 50 mL. Les symbiotes sont re-suspendus à plusieurs reprises dans de l’eau de mer filtrée afin de les purifier d’une quelconque contamination animale, centrifugés à nouveau pour récupérer le culot. Culot et surnageant sont directement congelés à l’azote liquide et placés à -20°C avant d’être lyophilisés. Un fraction des lyophylisats obtenus sont placés dans des capsules en étain, à raison de 1 mg de poudre pour les algues et de 10 mg de poudre pour le tissu animal, pour être analysées afin de déterminer les rapports isotopiques 13C/12C et 15N/14N, ainsi que les concentrations en carbone et en azote dans les échantillons. Ces mesures sont réalisées au moyen d’un spectromètre de masse (Delta Plus, Thermofisher Scientific) couplé à un analyseur élémentaire C/N (Flash EA, Thermofisher Scientific) par le Dr. Maguer à l’Institut Universitaire européen de la Mer (Plouzané, France).
Le carbone acquis, fixé via la photosynthèse (PC) peut suivre diverses voies métaboliques : il peut être incorporé dans la biomasse algale (
ρ
s) ou animale (ρ
h), respiré par l’animal (RH) ou les symbiotes (Rs) ou encore excrété dans l’environnement sous forme de carbone organique particulaire et dissous (COP, COD), ou carbone organique total (COT). La quantité de carbone allouée à la calcification du squelette n’a pas été incluse au modèle puisqu’il a été montré qu’environ 25% de carbone inorganique dissous provient du milieu extérieur et que 75% proviendrait de la respiration de l’holobionte (Rc= RH + Rs) (Erez 1978; Furla et al. 2000).Le bilan général se résume donc de la manière suivante :
P
C= R
C+ ρ
s+ ρ
h+ ρ
TOCLes équations détaillées du modèle concernant les taux d’incorporation du carbone dans l’animal, le pourcentage de carbone fixé restant dans les divers compartiments, la quantité de carbone perdue par la respiration ou l’excrétion de carbone organique total ainsi que la quantité de photosynthétats transférés sont disponibles dans la thèse de Pascale Tremblay (2012).
5.3 L’utilisation de l’isotope
15N de l’azote pour tracer le devenir
des molécules azotées au sein de la symbiose
Le paragraphe suivant détaille les étapes permettant de suivre le devenir des molécules azotées au sein de la symbiose, technique préalablement développée par Grover et al. (Grover et al. 2003; Grover et al. 2002) adaptée des équations de Dugdale & Wilkerson (1986).
La préparation de l’échantillon incluant la séparation des fractions animale et algale s’effectue de la même manière que celle énoncée dans le chapitre précédent (2.5.2). Dans le but de quantifier les flux d’azote, et donc les taux d’absorption entre le milieu extérieur et les fractions animale et algale, plusieurs paramètres ont été pris en compte : l’enrichissement 15N dans les tissus coralliens ainsi que dans le milieu extérieur, le temps d’incubation ainsi que la biomasse de la bouture.
L’enrichissement 15
N est mesuré sous la forme de :
5.4 Autre technique de mesure des taux d’absorption des sels
nutritifs
La technique de déplétion (Godinot et al. 2009) a également été utilisée pour mesurer les taux d’absorption d’ammonium, de nitrate et de phosphate par les boutures de coraux. Les fragments de colonies (5 réplicats), préalablement nettoyés, ont été disposés individuellement dans des béchers contenant 200 mL d’eau de mer filtrée et maintenus dans un bain marie à la température et à l’intensité lumineuse désirées. Trois béchers supplémentaires, ne contenant aucune bouture, ont servi de blancs de mesure qui évaluent les dérives aléatoires qui pourraient être causés par l’adsorption du sel nutritif sur les parois du bécher, à sa consommation par des bactéries ou encore à la contamination de l’air. Les coraux sont acclimatés durant 30 minutes avant d’enrichir le milieu à la concentration désirée de NH4Cl, NaNO3 ou NaH2PO4 par le biais d’une solution mère. Un barreau aimanté a servi à homogénéiser le mélange. Des échantillons d’eau (10 mL) sont prélevés au moyen d’une seringue reliée à un filtre de 0,45 µm et cela immédiatement après le début de l’enrichissement, puis de manière séquencée, après 15 min, 30 min, 45 min, 60 min et 90 min. Les concentrations en ammonium ont été déterminées de deux manières, immédiatement après l’échantillonnage selon la méthode de Holmes et al. (1999) à l’aide d’un spectrofluorimètre Xenius ® (Safas, Monaco) ou à l’aide d’un autoanalyser de sels nutritifs (Technicon, Alliance Instrument, AMS, France) comme pour le nitrate et le phosphate.
Le taux d’absorption de sel nutritif est calculé comme la différence de concentration mesurée entre les temps de prélèvement initial et final (T0 et T90), après avoir corrigé les données des blancs de mesure, de la diminution du volume des béchers et vérification de la linéarité de la déplétion tout au long de l’expérience. Les taux d’absorption sont normalisés par la quantité de protéine, la densité de symbiotes ou la surface (cm2) de chaque échantillon.!
6. Extraction d’ADN des coraux durs et du corail mou
pour la détermination du clade de Symbiodinium
L’extraction d’ADN de coraux durs et mous a eu pour but de déterminer le clade de
Symbiodinium présent au sein des tissus de l’hôte animal. Pour les coraux scléractiniaires,
l’extraction a suivi le protocole du kit « Genomic DNA buffer set » (Qiagen) et pour le corail mou, le « DNeasy Plant Mini kit » (Qiagen). Pour les deux types d’extraction, le corail est tout d’abord pilé dans du N2 avec ou sans EDTA puis traité avec les divers tampons des kits respectifs. A la fin de l’extraction, l’ADN est quantifié puis stocké à 4°C avant de procéder aux étapes suivantes. La détermination du clade de Symbiodinium suit le protocole développé par Santos et al., (2002). Le séquençage est établi sur 600-700 paires de base du gène ribosomal associé aux chloroplastes (23S).
7. Statistiques
Tous les résultats obtenus dans le cadre de cette thèse ont été exprimés sous forme de moyennes et écart-types ou erreurs standards (s.e.m ou SE). Afin de vérifier la normalité du jeu de données en question, un test de Kolmogorov-Smirnov ou Shapiro Wilk a été appliqué. L’homogénéité des variances a été vérifiée au moyen du test de Levene. Si ces conditions étaient remplies, l’effet des divers facteurs était testé au moyen d’analyses de variance (ANOVA simple, à deux facteurs ou analyse à mesures répétées) et suivi d’un test de comparaison multiple des moyennes (Tukey HSD). Si la normalité des données n’était pas vérifiée, et ceci, même après correction avec un logarithme naturel ou une racine carrée, des tests non-paramétriques étaient utilisés. Les valeurs étaient considérées significatives dans le cas où p < 0.05. Les analyses statistiques effectuées dans le cadre de la thèse ont été traitées au moyen du logiciel libre R (3.2.0) ou de Statistica version 10 (Softonic)