Chapitre 1 : Recherche d ’effecteurs de P. viticola reconnus par les vignes résistantes
1. Stratégie de recherche de résistances durables
1.1 Sélection d’effecteurs RXLR candidats de P. viticola
L’identification et la sélection de gènes candidats sont deux étapes déterminantes pour la suite de cette étude. Le but est d’utiliser dans le crible les séquences des effecteurs les plus propices à nous
Sélection de séquences
dont la prédiction est
robuste
Sélection de séquences
conservées
Sélection des séquences
exprimées au cours de
l’infection
4
Figure 28 : Critères de sélection des effecteurs RXLR candidats.
Plusieurs critères de sélection ont été appliqués sur les 256 effecteurs putatifs identifiés.
Vingt-deux gènes ont été séléctionnés (en jaune) pour la présence de motifs spécifiques aux RXLR
et une expression au cours de l’infection confirmée par RNA-seq. Vingt-six séquences ont
été séléctionnées (en vert) pour leur conservation à l’aide de l’analyse de SNP au sein de 27
isolats de P. viticola et dont l’expression a été confirmée par RNA-seq. Vingt-trois séquences
ont été séléctionnées (en bleu) pour présenter une expression forte à 48 hpi et la présence de
motifs spécifiques aux effecteurs RXLR. Au total, 51 effecteurs putatifs ont été séléctionnés.
Prédiction SNP
Expression
4
7
76 30 81
1 68
0
Homologie structurelle
aux effecteurs connus
Recherchée à l’aide de Phyre2
Homologie de séquence
aux effecteurs connus
Recherchée par BLASTp
Recherche de motifs
spécifiques aux
effecteurs RXLR
Figure 27 : Critères d’identification des effecteurs RXLR putatifs de P. viticola.
Les séquences codantes pour des effecteurs RXLR ont été recherchées au sein du protéome
de P. viticola via différentes approches: la recherche de motifs spécifiques aux effecteurs
RXLR (en vert), la recherche d’homologique de séquence (en bleu) et de structure (en
bordeau) avec des effecteurs RXLR connus dans les protéomes de P. sojae, P. halstedii,
Chapitre 1 : Recherche d’effecteurs de P. viticola reconnus par les vignes résistantes
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candidats dans le protéome de P. viticola ont été réalisées avant le début du projet de thèse ; en conséquence, ces processus ne seront pas abordés en détail ici.
L’identification d’effecteurs RXLR dans le protéome de P. viticola a été réalisée suivant deux
types d’approches : i) Un blast sur les séquences protéiques (blastp) contre une base de données
d’effecteurs RXLR connus et ii) une mise en évidence de motifs RXLR-dEER par recherche d’expressions
régulières (regex, Regular expression) et aussi à l’aide de modèles de Markov cachés (HMM). Après un
tri des séquences basé sur la présence d’un peptide signal et l’absence de motifs transmembranaires, une homologie structurelle des gènes candidats obtenus avec des effecteurs RXLR connus a été
recherchée. Les détails du processus d’identification d’effecteurs et les résultats obtenus sont
présentés dans la Section 1 du Chapitre 3, car ils ont été intégrés dans l’article (Combier et al.) soumis
à publication.
Un certain nombre de données de séquençage de P. viticola sont disponibles et régulièrement
mises à jour par de nouvelles techniques de séquençage. Dans un premier temps le transcriptome de
spores germées in vitrode l’isolat SC a été obtenu par séquençage Sanger, puis quelques années plus
tard par séquençage 454 à partir de spores germées in vitro et de feuilles infectées (Mestre et al.,
2016). Enfin, la technologie Illumina Solexa a permis le séquençage du génome de cet oomycète à partir de la souche PV221 puis à partir de 27 isolats différents.
L’identification d’effecteurs RXLR décrite ci-dessus a mis en évidence 256 séquences
candidates (Figure 27). Ensuite, trois critères ont été utilisés pour sélectionner des candidats prédits
comme essentiels à la virulence de P. viticola : 1) la robustesse de la prédiction, 2) la variabilité de
l’effecteur dans une collection d’isolats de P. viticola, basée sur le reséquençage de 27 isolats, et 3)
l’expression de l’effecteur lors de l’infection, sur la base de données de RNA-Seq à 48 heures post-infection (hpi) (Figure 28).
Les 37 effecteurs dont l’identification a été considérée la plus robuste (identifiées par Blast et recherche de motif) et ceux montrant une faible variabilité (définie comme un nombre de SNPs
non-synonymes ≤ 6) ont été retenus à condition que leur niveau d’expression à 48 hpi soit détectable dans
les trois répétitions des expériences de RNA-Seq. En parallèle, les 35 effecteurs les plus fortement
exprimés à 48 hpi ont été retenus pourvu qu’ils aient été identifiés par recherche de motif par au moins
une des méthodes utilisées.
In fine, ce processus a conduit à la sélection de 51 effecteurs, dont la répartition selon critères
de sélection est présentée dans la (Figure 28). Vingt-cinq d’entre eux seront utilisés pour la recherche
de résistances durables dans le cadre de la thèse. Nous avons choisi les 16 sélectionnés sur la base d’au
moins deux critères, et 9 autres montrant une forte expression au cours de l’interaction P. viticola / V.
Nom de
l’effecteur Nom original Taille (aa) Position RXLR
Motif
RXLR
Position
DEER Prédiction sur Phyre2 Homologues
Pv08 Plvit221r1_S0008g07301 149 33 RFLR 76 1
Pv19 Plvit221r1_S0464g40214 276 48 RTLQ 61 1
Pv24 Plvit221r1_S0035g12798 123 28 QHLR 42 1
Pv38 Plvit221r1_S0012g08108 186 37 RQKR 62 1
Pv40 Plvit221r1_S0023g10568 112 56 RFLR 76 2
Pv41 Plvit221r1_S0008g07299 134 56 RRLR 76 Avr3a4, effecteur RXLR de P. capsici (23.7%) 1
Pv44 Plvit221r1_S0464g40210 270 42 RTLQ 55 1
Pv52 Plvit221r1_S0042g14463 333 44 RGLR 55 Régulateur de réponse aspartate phosphatase, Kinesin light-chain 1 (99.9%) 2
Pv53 Plvit221r1_S0214g30354 513 47 RFLR 62 0
Pv55 Plvit221r1_S0411g38958 414 48 RKLR - 0
Pv57 Plvit221r1_S0229g31250 183 40 RRLR 60 Avr3 a11, effecteur RXLR de P. capsici (81.9%) 2
Pv58 Plvit221r1_S0008g07056 149 51 RSLR 74 0 Pv62 Plvit221r1_S0545g41401 116 48 RILR 60 0 Pv63 Plvit221r1_S0098g21208 202 48 RRLR 58 0 Pv64 Plvit221r1_S0278g33823 96 31 RSLR - 1 Pv65 Plvit221r1_S0256g32728 151 37 RLLR 49 2 Pv67 Plvit221r1_S0295g34737 95 46 RLLR - 0 Pv68 Plvit221r1_S0293g34653 425 38 RDLR - Phosphotransférase (100%) 1
Pv69 Plvit221r1_S0018g09472 180 51 RALR - Protéine de liaison au mannose et au glucose (100%) 1
Pv70* Plvit221r1_S0092g20511 111 40 HNLR 57 0
Pv72 Plvit221r1_S0062g17319 431 33 REER 54 Atr1, effecteur de H. arabidopsidis (79.8%) 1
Pv73 Plvit221r1_S0008g07303 134 56 RFRR - 0
Pv74 Plvit221r1_S0156g26436 207 57 RYLQ 67 Mob1 de la famille des phoceines (80.1%) 1
Tableau 4 : Liste des effecteurs RXLR candidats sélectionnés pour le crible. En blanc les gènes qui ont pu être amplifiés et clonés dans un vecteur binaire pour
expression transitoire à l’aide d’A. tumefaciens. En gris, les effecteurs séléctionnés qui n’ont pas pu être clonés au cours de la thèse. *, deux allèles de Pv70 ont
été clonés.
J-1 J-7
Agroinfi ltra on foliaire
des eff ecteurs candidats
et du contrôle néga f GUS
Observa on
des symptômes
à la loupe binoculaire
Deux phénotypes sont possibles :
Aucun symptôme
visible
L’individu ne possède pas
de facteurs de résistance
correspondant à l’eff ecteur
testé
Appari on de
nécroses de type HR
L’individu possède un facteur
de résistance correspondant à
l’eff ecteur testé
Agrobactéries
Figure 29 : Procédure u lisée pour iden fi er des vignes qui possèdent un gène de résistance.
Sur les vignes maintenues in vitro ou en serres, les feuilles de rang 2 à par r de l’apex sont récoltées
et découpées à l’emporte-pièce puis leur face abaxiale est submergée dans une suspension d’A.
tumfaciens porteuse du gène codant pour l’eff ecteur testé ou pour le contrôle néga f GUS ou Myba1.
L’adjuvant Silwet L-77® (0.03%) est u lisé pour augmenter la surface de contact entre la suspension
bactérienne et le ssu végétal grâce à ses propriétés d’hyper mouillant et de pénétrant. Les disques
sont ensuite lavés à l’eau ultra-pure et déposés sur papier Watman humide en boite de Pétri. A par r
de 6 jours après agroinfi ltra on (jpa), les disques sont observés et photographiés à la loupe binoculaire.
Des marques de HR sont recherchées sur les disques.
Le test est réitéré sur l’ensemble
de la popula on dont est issu l’individu.
Intégra on du marqueur
«Appari on de HR» aux cartes géné ques.
Le gène de résistance peut être recherché
dans le génome du parent résistant.
Vignes résistantes
Vignes sensibles
Aucun symptôme
visible
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