RuvAB

2.4.1 Action via RuvA sur les jonctions de Holliday

RuvB a une faible affinité pour les jonctions de Holliday et le rôle de RuvA est de recruter RuvB vers la jonction [126, 128, 133, 154, 155]. En fait RuvA et RuvB aug- mentent mutuellement leur affinité pour la jonction de Holliday et l’on observe qu’en

40 Le Complexe RuvABC présence d’ADN, et encore plus en présence de jonctions de Holliday, RuvA stimule l’ac- tivité ATPase de RuvB [120, 125–127, 139, 154, 156, 157].

2.4.2 Migration des jonctions de Holliday : rôle moteur de RuvB

et rôle structurel de RuvA

RuvB interagit avec RuvA pour faire migrer les jonctions de Holliday en hy- drolysant de l’ATP [125, 126, 128, 139, 156]. RuvB est donc reconnue comme constituant le moteur du complexe RuvAB qui intervient dans la migration des jonctions de Holli- day [127].

L’existence de ce complexe a été confirmée de plusieurs façons. Tout d’abord, bien que RuvB soit capable à elle seule de faire migrer la jonction [154, 156, 158], cette activité ne peut avoir lieu que dans des conditions particulières : absence de sel, haute concentration en protéines et parfaite homologie entre les brins d’ADN échangés. Il ne s’agit donc pas d’une activité compatible avec les conditions in vivo.

D’autre part, RuvA et RuvB peuvent s’assembler en présence d’ions divalents [157] et forment, en présence de nucléotides non-hydrolysables, un complexe spécifique et stable sur la jonction de Holliday [120, 126].

Enfin, il a été montré que RuvA est requise de façon continue au cours de la migration [158], confirmant l’idée que RuvA et RuvB agissent ensemble sous forme d’un complexe.

2.4.3 Structure du complexe RuvAB

Concernant la structure du complexe, des études par DNaseI footprinting [159] et des expériences de microscopie électronique [130,160,161] ont montré que RuvA et RuvB s’assemblent sur les jonctions de Holliday pour former un complexe où la jonction est prise en sandwich par deux tétramères de RuvA, et où deux hexamères de RuvB s’assemblent à leur tour sur deux brins opposés de la jonction, de part et d’autre de RuvA (figure 2.4). Néanmoins, dépendant de la concentration relative des protéines RuvA et RuvB, il a été observé des complexes de stœchiométries différentes, où RuvA chargée sur la jonction était encadrée par un, trois ou quatre hexamères de RuvB [161] (figure 2.5) ; ces formes de complexes sont présumées ne pas être des formes actives de la protéine.

2.4.4 Rôle actif de RuvA

La fonction de RuvA ne se limite pas à un rôle structurel en servant simplement à assurer le maintien en contact entre la jonction de Holliday et le moteur RuvB. Tout d’abord, concernant l’interaction de RuvA avec la jonction de Holliday, lorsque l’on com- pare les structures à un ou deux tétramères, celles-ci présentent une certaine diversité de conformations [129], notamment en ce qui concerne l’état des paires de bases au point de branchement, qui peuvent être soit appariées soit ouvertes selon les cas [123,124]. Ces dif- férences de conformation suggèrent l’existence d’une dynamique dans l’interaction entre les tétramères de RuvA et la jonction.

Par ailleurs, on sait que RuvA influe sur l’activité migratoire de RuvB ainsi que sur l’activité endonucléase de RuvC (voir section suivante) [105, 121]. Cette modulation

RuvAB 41

Figure 2.4 – Structure du complexe RuvAB modélisée à partir des structures obtenues en microscopie électronique [162]. Ici, un seul tétramère de RuvA a été représenté fixé sur la jonction. Encart : image en microscopie électronique d’un complexe RuvAB chargé sur une jonction de Holliday (voir aussi figure 2.5).

4 hexamères

1 hexamère 2 hexamères

3 hexamères

a

b

Figure2.5 – Microscopie électronique de complexes RuvAB chargés sur des jonctions de Holliday (image tirée de [161]). (a) Effet de la concentration relative de RuvA et RuvB sur la stœchiométrie des complexes RuvAB formés. Lorsque l’on augmente le rapport des concentrations RuvB/RuvA, on augmente le nombre moyen d’hexamères de RuvB chargés sur chaque jonction. (b) Champ de vue plus large, montrant deux complexes contenant chacun deux hexamères de RuvB (flèches). C’est la stœchiométrie présumée pour un com- plexe actif pour la migration.

42 Le Complexe RuvABC

Figure2.6 – Structure cristallographique représentant deux tétramères de RuvA où quatre des sous-unités interagissent spécifiquement avec le Domaine I d’un monomère de RuvB [163].

se fait tout d’abord directement à travers le domaine de la protéine RuvA en contact avec RuvB [164] (voir figure 2.6), mais aussi de façon plus indirecte, à travers les 4 pointes acides du tétramère [121,134] (figure 2.2). Étonnamment, des mutations au niveau de ces pointes peuvent entraîner par exemple une accélération de la migration [121].

Tous ces résultats démontrent que RuvA a un rôle structurel actif au cours de la migration, et confirment ainsi que c’est le complexe RuvAB, et non la protéine RuvB seule, qui constitue la forme active naturelle.

2.4.5 Activité migratoire de RuvAB

Le sens de migration de la jonction est déterminé par la position des hexamères qui déplacent la jonction en tirant chacun le double brin d’ADN qu’il entoure hors du tétramère de RuvA [159, 161, 165] (voir figure 2.4).

Par ailleurs, RuvAB est capable de dissocier le filament RecA [166] après que celui-ci ait initié la recombinaison à partir d’une région simple brin.

Migration à travers les hétérologies et les lésions UV

Concernant la migration en présence d’hétérologies de séquences, il a été montré récemment sur des expériences en molécule unique [167] qu’une hétérologie de 20 paires de bases est un obstacle important à la migration de la jonction par RuvAB. De plus, la migration semble devoir démarrer dans une zone d’homologie [127].

RuvC 43 En revanche, le franchissement d’hétérologie est considérablement facilité par la présence de SSB (Single-Strand Binding proteins1

) qui autorisent le franchissement de 1.8 kb d’hétérologie de séquence [168]. Par ailleurs sur des expériences de recombinaison à trois brins (un ADN simple brin et un ADN double brin) [169, 170] ou à 4 brins avec un des ADN portant une insertion [171], RuvAB et RecA peuvent agir ensemble pour faciliter le franchissement de l’hétérologie.

Par ailleurs, RuvAB est capable de faire migrer la jonction de Holliday à travers des lésions d’ADN causées par les UV [156].