Une des questions qui peuvent se poser dans le cas d’un complexe tel que RuvAB est de savoir comment celui-ci fonctionne, et en particulier par quel mécanisme l’hydrolyse des nucléotides, les changements de conformation du complexe et l’échange des simples brins peuvent être couplés. Comme nous allons le voir, les structures cristallographiques, les caractéristiques de l’activité du complexe ainsi que l’étude de mutants permettent de répondre partiellement à cette question.
2.6.1 Structure et interaction des sous-unités RuvA et RuvB
Les études cristallographiques de RuvA montrent que la protéine, sous forme de monomère, est constituée de trois domaines [119]. Les domaines I et II forment le cœur du tétramère, et sont impliqués dans la reconnaissance de la jonction de Holliday [122–124]. Le domaine III est impliqué dans l’interaction avec RuvB [131, 164].Les structures cristallographiques de monomères de RuvB ont permis d’identifier trois domaines dans la sous-unité [103, 151] (figure 2.9). Les deux premier domaines (Do- maine I ou "N-terminal" et domaine II ou "M") contiennent des motifs Walker A et B (motifs hélicase I et II) ainsi que des motifs Sensor 1 et 2, qui caractérisent les membres de la famille AAA+ et sont impliqués dans la reconnaissance et l’hydrolyse des nucléotides, la reconnaissance de l’ADN et les changements de conformation [150]. Par ailleurs, le do- maine I est également impliqué dans l’interaction avec RuvA [163]. Le troisième domaine (Domaine III ou "C-terminal") est similaire au motif "winged-helix" impliqué dans le contact avec l’ADN.
La mutation de résidus à l’interface entre RuvA et RuvB provoquent des défi- ciences dans l’activité migratoire du complexe RuvAB [131, 194] montrant que l’interac- tion RuvA-RuvB est essentielle pour le bon fonctionnement (activité ATPase et activité migratoire) du complexe. En outre, il apparaît que l’interaction entre RuvA et l’une des sous-unités de l’hexamère de RuvB impose une déformation importante de l’anneau [163], suggérant que cette interaction joue un rôle dans la régulation du fonctionnement de l’hexamère.
Enfin, les différentes structures obtenues révèlent une grande flexibilité dans les postions relatives des domaines et des sous-unités [122, 129, 131, 160, 163, 164], soulignant l’importance des changements de conformation dans le fonctionnement du complexe.
2.6.2 Activité ATPase et effet des mutations
Une première étude de l’activité ATPase de RuvB a été réalisée par l’équipe de S.C. West [137]. Puis des études plus exhaustives, en présence [195] ou en l’absence [196] de RuvA, ont été menées par l’équipe de Michael M. Cox. Ces études ont mis en évidence la complexité de l’activité ATPase de la protéine.
L’hydrolyse de l’ATP dépend en effet de la concentration en protéines, de la concentration en ATP (qui peut avoir un rôle inhibiteur au delà de 2mM), de la présence ou non de RuvA et du substrat utilisé (ADN simple brin, double brin, linéaire ou circulaire). De plus l’activité ATPase de RuvB seule en présence d’ADN double brin linéaire s’arrête au bout de quelques dizaines de cycles par unités si une concentration en ATP inférieure au KM (constante de Michaelis-Menten) est utilisée.
46 Le Complexe RuvABC
Figure2.9 – Vue partielle des domaines de RuvB et de leurs positions éventuelles dans un hexamère de RuvB entourant un double brin d’ADN (image tirée de [151]). L’interaction avec RuvA, qui n’est pas représentée ici, se fait via le domaine I (en bleu). Le site de fixation de l’ATP est fromé par les domaines I et II, et se trouve à l’interface entre deux sous-unités. La fixation de l’ATP est couplée à un mouvement du Domaine III qui vient alors entrer en contact avec l’ADN [151, 163].
Ces études ont également révélé une brisure de symétrie dans l’anneau hexamé- rique de RuvB puisqu’il semble que les molécules d’ATP sont hydrolysées par groupe de 2. D’autre part, la nette augmentation de l’activité ATPase en présence d’ADN circulaire suggère que les hexamères de RuvB sont capables de se déplacer le long de l’ADN.
Certains mutants de RuvB ont été isolés et étudiés vis-à-vis de leurs effets in vivo ou vis-à-vis de leurs propriétés biochimiques in vitro. La caractérisation de ces mutants (éventuellement en association avec la protéine sauvage ou avec une autre protéine mutée (hétérohexamères)) permet de mettre en évidence des propriétés importantes pour com- prendre le fonctionnement de RuvB. Plus précisément, les mutations suivantes ont été étudiées : des mutations dans le motif Walker A sur les résidus K68 ou T69 [197,198], des mutations entre les motifs Sensor 1 et Sensor 2 (résidu R174 proche du γ-phosphate du nucléotide) [199], des mutations double K68A-R174A [199], des mutations dans le motif Walker B (résidu D113) [200, 201], des mutations dans le motif "winged-helix" (résidu R318) [152], et enfin des mutations du résidu L268 (dans le domaine III) [202].
Ces études ont par exemple permis de montrer que la protéine RuvBD113E est
capable de former des hexamères et de catalyser, en association avec RuvA, la migration des jonctions de Holliday. Cependant, ses activités ATPase ou hélicase se trouvent réduites. Ces résultats peuvent suggérer des modèles de fonctionnement [201].
Par ailleurs, les homohexamères de RuvBK68A, RuvBR134A ou RuvBK68A−R174A
sont déficients en activité ATPase, mais en revanche l’activité ATPase est restaurée chez les hétérohexamères formés par RuvBK68A et RuvBR134A en proportions 1 :1, mais pas
l’activité migratoire [199]. Il ressort de ces études que le site catalytique des nucléotides est formé par l’assemblage de deux sous-unités de RuvB et se trouve donc à l’interface entre ces deux sous-unités. Dans ce site catalytique, l’une des sous-unités joue un rôle allostérique permettant de stimuler l’hydrolyse du nucléotide par la sous-unité adjacente [199].
Questions en suspens 47 Enfin, il a été montré que les cellules qui expriment RuvBL268S sont très sensibles
aux UV, alors qu’in vitro, et en présence de RuvA et de RuvC, la protéine RuvBL268S est
totalement active en ce qui concerne l’activité migratoire ou le clivage [202]. Ce résultat suggère que RuvB est susceptible de jouer in vivo d’autres rôles encore méconnus.