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3. Les techniques

3.5. Les RTqPCR

3.5.1. Extraction d’ARN

L’extraction d’ARN est une étape délicate, puisque les ARNs sont très sensibles à la dégradation. Avant toute expérimentation impliquant de l’ARN, les plans de travail ainsi que le matériel utilisé doivent être désinfectés avec une solution de RNAse (Ambion, ref AM9782), permettant de dégrader toute enzyme de dégradation des ARN éventuellement présentes. Ces conditions, qualifiées de « RNAse free », doivent être maintenues tout au long de la manipulation.

Dans nos expérimentations, nous avons utilisé des tapis cellulaires (HFFs ou RAWs) infectés avec les diverses souches de parasites. Après infection d’une nuit, et traitement ou non des cellules avec des substances comme l’IFN , les tapis cellulaires infectés sont rincés une fois au PBS1x (Gibco, ref 14190-094), et récoltés grâce à un râteau. Après centrifugation 5 minutes à 400 xg, du TriZol (Ambion, ref 15596018) est ajouté, le volume étant ajusté en fonction de l’échantillon de départ. Dans nos expérimentations, 1 mL de Trizol est ajouté à une flasque 75 cm2 de cellules HFFs ou à une flasque 25 cm2 de cellules RAW. Le TriZol étant toxique et irritant, ces étapes se déroulent sous hotte chimique. Les culots de cellules sont resuspendus plusieurs fois pour permettre également une lyse mécanique. Le TriZol est composé de phénol et d’isothiocyanate de guanidine, ce dernier étant un inhibiteur de RNAses. Après incubation de 5 minutes, environ 1/5ème de volume de chloroforme (Chimie +, ref 40022) est ajouté (environ 200 µL dans notre cas), et les tubes sont fortement secoués (et non vortexés) pendant quelques secondes, puis incubés 2 à 3 minutes à température ambiante. Après centrifugation 15 minutes à 12 000 xg, la phase supérieure est prélevée (environ 400 µL), mélangée par vortex à 500 µL d’isopropanol 100% (Carlo ARBA, ref 415154), et incubée 10 minutes. Après centrifugation 10 minutes à 12 000 xg, le culot est lavé 2 fois à l’éthanol 75%, et après séchage, repris dans environ 30 µL d’eau stérile (Invitrogen, ref 10977-035).

3.5.2. Rétrotranscription

La rétrotranscription a été réalisée à partir des ARN précédemment extraits, grâce à un kit commercial Taqman (Applied Biosystem, ref 4366596) . Brièvement, 2 µg d’ARN sont utilisés, et mis en présence d’enzyme de rétrotranscription 20x, de tampon de solution 2x et d’eau,

dans un volume final de 20 µL. Le mélange est ensuite placé à 37°C pendant 1 heure, et la réaction est arrêtée par une étape d’inactivation de l’enzyme 5 minutes à 95°C. Une fois la réaction finie, les échantillons sont dilués dans un volume final de 50 µL environ. L’ADN complémentaire (ADNc) ainsi généré sera utilisé comme matrice pour les PCR quantitatives.

3.5.3. RTqPCR

Le principe de la PCR quantitative en temps réel consiste à évaluer la quantité d’ADNc dans chaque échantillon, reflétant elle-même la quantité d’ARN des échantillons de départ, et donc l’expression génique des cellules infectées. Une sonde spécifique correspondant au gène recherché est ajoutée à l’ADNc, et se lie à celui-ci. Grâce à une polymérase, l’ADNc va être amplifié sur le principe de la PCR, et la progression va être suivie et quantifiée en temps réel. En effet, la sonde Taqman possède un fluorophore, ainsi qu’un désactivateur (ou « quencher »). Quand ces 2 éléments sont proches physiquement, soit quand la sonde est intacte, le fluorophore est inhibé, et le signal n’est pas produit. Lors de l’élongation, la polymérase dégrade la sonde hybridée, libérant ainsi le fluorophore, qui au contact de la lumière, émet une fluorescence, qui est détectée par le thermocycleur. La quantité de sonde hybridée est donc directement liée à la fluorescence détectée par l’appareil.

Pour ce protocole, le kit Taqman (Applied Biosystem, ref 4369016) a été utilisé. Les réactions s’effectuent en plaques 96 puits (Applied Biosystem, ref 4346906), suivant un schéma de plaque établi au préalable par l’utilisateur. Il est nécessaire de prévoir pour chaque sonde, un échantillon de référence (dans notre cas, les cellules non infectées, non stimulées), ainsi qu’un contrôle négatif où l’échantillon est remplacé par de l’eau. De plus, une série de réactions doit être attribuée pour chaque plaque 96 puits à une sonde de référence ( 2 microglobuline dans notre cas). Les réactions ont été réalisées en duplicats. Les réactions nécessitent chacune 10 µL de mix (contenant enzyme, nucléotides, et tampon), 1 µL de sonde, et 5 µL d’eau stérile. Après dispersion de 16 µL par puits, 4 µL d’ADNc sont répartis dans les puits adéquats, et ce pour toutes les sondes souhaitées. Les plaques sont ensuite scellées par un film plastique (Applied Biosytem, ref 4311971), et centrifugées quelques secondes à 500 xg. Enfin, les plaques sont insérées dans le thermocycleur, et le programme est lancé. Il se compose d’une phase de dénaturation initiale avec une étape à 50°C pendant 2 minutes, puis à 95°C 10 minutes, et enfin de 40 cycles répétés comprenant la dénaturation (95°C, 15 secondes), et l’hybridation et l’élongation (60°C, 1 minute).

Les sondes utilisées sont les suivantes (Applied Biosystem) :

- Sondes humaines : Cxcl9 (Hs00171065_m1), Cxcl10 (Hs00171042_m1), Mx1 (Hs00895608_m1), GBP2 (Hs00894837_m1), 2microglobuline (Hs00984230_m1)

- Sondes murines : Cxcl9 (Mm00434946_m1), Cxcl10 (Mm00445235_m1), Mx1 (Mm00487796_m1), GBP2 (Mm004945576_m1), IRGb6 (Mm01295120_m1),

Bibliographie

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