2.1.1. pLIC
La technique de pLIC (pour Ligation Independent Cloning) est une alternative au clonage par enzymes de restriction (Figure 26). Dans notre cas, cette technique va nous permettre d’étiqueter un gène en C terminal en le laissant sous le contrôle de son promoteur endogène. Le gène d’intérêt est amplifié par PCR à partir de l’ADN génomique du parasite, grâce à des oligonucléotides contenant des séquences spécifiques au LIC. L’insert est ensuite traité avec l’ADN polymérase T4 (Novagen, ref 69197) en absence de dNTP, mais seulement de dCTP. Dans ces conditions, l’enzyme ne peut effectuer la réaction de polymérisation, et va avoir à l’inverse une activité 3’-5’ exonucléase. Du fait de la présence de dCTP, l’activité d’excision va cesser une fois le premier nucléotide C rencontré, l’enzyme est à l’arrêt. Après digestion du vecteur, il est traité par la même enzyme, en présence de dGTP, afin de créer des brins complémentaires à celui de l’insert. Les parties s’assemblent sans besoin de ligation, et le vecteur transformé en bactérie est assemblé et amplifié.
Le vecteur ainsi complet est linéarisé par un site unique se trouvant dans la séquence du gène d’intérêt, et est transfecté dans une souche ku80. Ce système permet normalement la recombinaison non homologue ; dans les souches ku80, le seul système de réparation existant est celui de la recombinaison homologue. Dans notre cas, le parasite pourra intégrer le vecteur linéarisé au locus du gène d’intérêt, et ainsi permettre le marquage endogène.
Les oligonucléotides suivants ont été utilisés (les séquences en bleu correspondent à la partie LIC) : LIC-TgIST-FWD : 5’- TACTTCCAATCCAATTTAGCTCGTCCGACCGCGGACGTCGTTCTCCTG -3’ LIC-TgIST-REV : 5’- TCCTCCACTTCCAATTTTAGCGACCCGCCGTTCACTACTCGGCGGCCGGCG -3’ LIC-TgISTpromGene-FWD : 5’- TACTTCCAATCCAATTTAGCTCACGGACGACTGGCAAGACACAGAATG -3’ LIC-TgISTpromGene-REV : 5’- TCCTCCACTTCCAATTTTAGCGACCCGCCGTTCACTACTCGGCGGCCGGCG -3’ LIC-TgIST-C-FWD : 5’- TACTTCCAATCCAATTTAGCCTCCGGATATGGATACCTCTTTCAC -3’ LIC-TgISTC394-REV : 5’- TCCTCCACTTCCAATTTTAGCGATTTCTTTGCCTGTCCGGATAGGCG -3’ LIC-TgISTC576-REV : 5’- TCCTCCACTTCCAATTTTAGCCTTGGCGATGCCACGCGACGGCTCTC -3’ LIC-TgISTC755-REV : 5’- TCCTCCACTTCCAATTTTAGCCTGCCTCAAGACGCTCTGTCCAGGTAAG -3’
2.1.2. CRISPR/Cas9
La Cas 9 est une endonucléase d’ADN double brin guidée par ARN., et est associée aux courtes répétitions palindromiques regroupées et régulièrement espacées (CRISPR : clustered regularly interspaced short palindromic repeats). A l’origine, ce système appartient à l’immunité adaptative de certaines bactéries, dont Streptococcus pyogenes, et détecte l’ADN étranger pour le cliver via une séquence de 20 nucléotides complémentaires (Figure 27).
Figure 27 : Principe du CRISPR/Cas9
Le vecteur CRISP contenant la séquence spécifique d’ADN correspondant à l’ARN guide et la séquence codant pour la DHFR (en rouge) flanquée de régions homologues sont transfectés ensemble dans les parasites. L’ARN guide est transcrit dans la cellule par l’ARN polymérase III, la Cas9 est produite et s’assemble avec l’ARN guide. Le complexe rejoint le noyau de la cellule, l’ARN se fixe à la séquence cible par complémentarité, et l’enzyme clive l’ADNg sur ses 2 brins. L’ADN codant pour la DHFR intègre l’ADNg grâce aux séquences flanquantes homologues.
ADNg : ADN génomique ; ARNg : ARN guide ; ARNcr : ARN complémentaire ; ARNtracr : ARN de structure
La technique de CRISPR/Cas9 est utilisée en biotechnologies pour modifier l’ADN de façon irréversible. La séquence guide est composée de 20 nucléotides précédant une séquence PAM (protoscaper adjacent motif) composé du trio NGG, ou N représente l’un des 4 nucléotides présent dans l’ADN. La séquence guide doit préférentiellement commencer par un G, afin de permettre une meilleure transcription par le promoteur U6 (Figure 27), reconnu par l’ARN polymérase III.
La première étape consiste à phosphoryler les oligonucléotides afin d’optimiser la liaison au vecteur. La phosphorylation est assurée par l’enzyme T4 polynucleotide kinase (Invitrogen, ref 18004-010). Après incubation à 37°C pendant 30 minutes, et arrêt de la réaction par incubation 10 minutes à 65°C. La dénaturation de l’enzyme et l’assemblage des oligonucléotides phosphorylés s’effectue par ajout de tampon NaCl/EDTA (10x), durant un programme qui descend progressivement de 95°C à 25°C à raison de 1°C de perte toutes les 30 secondes. Après dilution au 1/50 des oligonucléotides phosphorylés, ils sont ajoutés au vecteur digéré CRISPR/Cas 9, en présence de la T7 DNA ligase (New England Lab, ref M0318L), et le mélange est incubé à 25°C pendant 1 heure. Le mélange est ensuite transformé en bactéries compétentes : après incubation des bactéries et du mélange dans la glace pendant 30 minutes, les bactéries sont plongées pendant 40 secondes dans un bain-marie à 42°C. Ce choc thermique va permettre l’entrée du vecteur dans la bactérie par l’altération de ses membranes. Après récupération pendant quelques minutes sur la glace, les bactéries sont préincubées dans un milieu riche pendant 30 minutes environ, puis étalées sur boîtes de pétri contenant du LB-Agar et de l’ampicilline à 100 µg/mL. Après une croissance de quelques heures, des colonies apparaissent, et doivent être testées pour la présence du vecteur ou non. Les colonies positives sont amplifiées et le vecteur est purifié par Midiprep (Macherey-nagel, ref 740410.50).
Le vecteur comprenant la Cas 9 et l’ARN guide est transfecté dans le parasite en même temps que la séquence codante pour la cassette de résistance DHFR, flanquée de séquences homologues pour permettre l’intégration au site de coupure. Ce processus résulte en la délétion totale du gène d’intérêt.
Les oligonucléotides suivant ont été utilisés : TgIST-CRISP-FWD :
5’- AAGTTGTTCTCGCAGGAGCTCCTCTG -3’
TgIST-CRISP-REV :
Les séquences en gras correspondent au site de coupure BsaI. TgIST-DHFR-FWD : 5’- GGACCCAGTTCTGTGGGCCGTGGAAGCCCGGGCTTCGCCAGGCTGTAAATCCCGTG -3’ TgIST-DHFR-REV : 5’- CTGCCCGCAAATGCATCCACCCACTAGACCCGGAATTCATCCTGCAAGTGCATAG -3’ DHFR-FWD : 5’- GCTTCGCCAGGCTGTAAATCCCGTG -3’ DHFR-REV : 5’- GGAATTCATCCTGCAAGTGCATAG -3’ 2.2. Transfection transitoire
L’intérêt d’une transfection transitoire est qu’elle ne nécessite pas de sélection, et le processus est donc rapide. La transfection a lieu à J0 (jour de l’expérimentation), puis les parasites infectent les tapis cellulaires pendant une nuit. Les immunofluorescences sont réalisées le lendemain, à J1.
Afin d’assurer un bon taux de transfection, les parasites doivent être fraîchement lysés. L’équivalent d’une flasque 25 cm2 est récupéré et centrifugé à 900 xg pendant 7 minutes. Ensuite, le culot de parasites est délicatement resuspendu et lavé dans une solution de cytomix (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 10 mM KH2PO4/KH2PO4 à pH 7,6, 25 mM HEPES à pH 7.6, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2). Après une nouvelle centrifugation, les parasites sont dilués du cytomix. Le volume utilisé pour cette dilution varie selon les souches. Ainsi, une flasque 25 cm2 de parasites RH ku80 contient beaucoup de parasites, et la dilution sera effectuée dans un volume d’environ 400 µL. La souche de type 2 est diluée dans environ 300 µL. Enfin, la souche COUG étant plus fragile, les parasites sont repris dans seulement 200 µL de cytomix. Environ 150 µL de parasites resuspendus sont ensuite mélangés délicatement à l’ADN à transfecter. La quantité d’ADN nécessaire varie selon l’utilisation nécessaire. Dans le cas de nos transfections transitoires, nous avons transfecté environ 90 µg d’ADN circulaire. Une fois le mélange parasite-ADN prêt, celui-ci est transféré rapidement dans une microcuve de 2 mm (MBP, ref 5520), et subit une électroporation à 1100 V, 25 ohm et 25 F, dans un appareil BTX ECM 630 (Harvard Apparatus). Parce que le voltage requis n’est pas atteint en un seul choc, 2 chocs successifs sont nécessaires. Les parasites sont ensuite directement transférés sur
des tapis cellulaires disposés sur des lamelles, en plaque 4 puits. Au temps désiré, après 24 heures dans notre cas, des immunofluorescences sont réalisées.
2.3. Transfection stable
Afin de modifier de manière permanente les différentes souches, des transfections stables ont été réalisées. La préparation des parasites est la même que pour les transfections transitoires, mais la différence réside dans le mélange à l’ADN et le devenir des parasites. En effet, dans le cas du CRISPR/Cas 9, en plus du vecteur, des cassettes de sélections doivent être transfectées, pour permettre la sélection des parasites les ayant intégrés. Dans notre cas, nous avons généré la cassette de résistance à la DHFR par PCR, avec des régions adjacentes ou non du gène d’intérêt selon la souche utilisée. En effet, les souches ku80 favorisent fortement la réparation homologue, et l’ajout de régions adjacentes permet d’optimiser l’intégration de la cassette. En revanche, les souches 76K et COUG possèdent en plus le système de réparation non homologue. Dans ce cas, l’intégration au site est plus difficile, et ne nécessite pas de régions adjacentes. La co-transfection du vecteur CRISPR/Cas 9 et de la cassette DHFR se fait avec un ratio d’environ 1 pour 10, en faveur du vecteur. Le principe est que statistiquement, toute cellule ayant reçu la cassette DHFR aura aussi reçu le vecteur. Concernant le vecteur LIC, la recombinaison au site n’est permise que dans le cas d’une souche ku80.
Après l’électroporation, les parasites sont incubés en flasque 25 cm2 sur un tapis de cellules HFFs (P0, ou passage 0). Dans la plupart des cas, 24 heures plus tard, le tapis est lysé, et les parasites sont centrifugés 7 minutes à 900 xg, puis remis dans une nouvelle flasque 25 cm2
de HFF avec 1 µM de pyriméthamine (Fluka, ref 46706), ce qui constitue le P1. Dans le cas des parasites COUG, 24 heures ne suffisent pas pour passer du P0 au P1 ; le milieu de culture est changé délicatement pour un nouveau milieu contenant la pyriméthamine à 1 µM. A partir de l’ajout de pyriméthamine, la croissance de la culture parasitaire est ralentie en raison de la mort des parasites n’ayant pas intégré la cassette de résistance. A partir de P5, les parasites sont régulièrement testés ; par immunofluorescence dans le cas de l’étiquetage endogène (pLIC), ou par PCR au locus d’intérêt après extraction d’ADN dans le cas de la délétion du gène (CRISPR/Cas 9). Une fois la confirmation d’une certaine proportion de la population correctement transfectée, les parasites sont sélectionnés par processus de dilution limite. A partir d’une flasque 25 cm2 lysée, et par dilutions successives, les parasites sont ensemencés en plaque 96 puits, afin qu’elles contiennent théoriquement 1 parasite par puits. Après incubation des plaques à 37°C, 5% CO2, pendant 8 jours, les plaques sont examinées au microscope, et les puits contenant une plage de lyse unique sont sélectionnés. Après lyse
totale, les parasites issus de ces puits sont remis en culture, et sont testés en immunofluorescence ou par PCR.
De cette façon, les souches suivantes ont été élaborées : RH ku80 TgIST, RH ku80- ASP5-TY – TgIST-HA-FLAG, RH ku80 asp5-PTgIST-TgIST-HA-FLAG, Pru ku80-TgIST-HA-FLAG, Pru ku80 TgIST, Pru ku80-TgIST-C394, Pru ku80-TgIST-C576, Pru ku80-TgIST-C755
76KGFP/LUC TgIST, COUG TgIST, COUG myr1.