RTPCR quantitative en temps réel (RTQ-PCR)

La RTQ-PCR (Real time quantitative polymerase chain reaction) ou réaction de polymérisation en chaine (PCR) quantitative en temps réel, permet de quantifier l’expression du gène d’intérêt.

Le principe de cette technique consiste à l’amplification d’un fragment d’ADN correspondant au gène étudié et présent dans un échantillon d’ADNc (complémentaire de la séquence d’ARNm). C’est une amplification par réplications successives d’un fragment ADN situé entre 2 amorces de polymérisation grâce à un enzyme thermostable la Taq polymérase. Le but est d’obtenir une quantification de la réaction d’amplification, une cinétique au cours de la PCR. La courbe de l’évolution de la quantité d’ADN au cours du temps est décomposée en trois phases: la phase exponentielle, la phase linéaire et la phase plateau (Figure 14).

La PCR quantitative en temps réel permet de suivre au cours du temps, l’évolution de la quantité d’ADN (et donc d’ARNm) présente dans la réaction grâce à la fluorescence. Après chaque cycle de PCR, les données de la fluorescence représentant la quantité d’ADN amplifié à chaque cycle, sont enregistrées. La phase exponentielle, phase la plus reproductible, est modélisable, est décrite par l’équation: XN=X0. (1+E)^N

Où XN représente le nombre de copies engagées au cycle N X0 est le nombre de copies initiales

E est l’efficacité de la réaction de la PCR, compris entre 0 et 1. (1+E)^N est le facteur d’amplification

N est le nombre de cycles.

Si E=1, la quantité de produit de PCR obtenue après amplification est XN =2^N X0.

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Le cycle – seuil (cycle threshold en Anglais, Ct) représente le nombre de cycles à partir duquel le signal de fluorescence émis sera plus élevé que le bruit de fond du détecteur de fluorescence et devient spécifique de l’amplification du gène d’intérêt au cours de la réaction. A partir de dilutions sériées, des courbes d’amplification décalées d’un Ct les unes par rapport aux autres sont obtenues. Ces courbes permettent de construire une droite d’étalonnage témoignant d’une relation linéaire inverse entre le Ct et le logarithme du nombre de cibles engagées dans la réaction de PCR L’équation de la droite est obtenue en prenant le logarithme de l’équation XN =X0. (1+E)^N où N=Ct.

Log(XN) =log(X0) +N.log (1+E) Log(XN) =log(X0) +Ct.log (1+E) Ct= [log(XN )-log(X0)]/log (1+E)

Ct= -1/log (1+E). log(X0) +log(XN )/log(1+E)

Pour une RTQ-PCR donnée, la quantité de produit de PCR détectée au Ct est constante. L’équation obtenue est celle d’une droite dont la pente est a (a=-1/log (1+E)): Ct=a.log(X0)+b Les pentes des droites d’étalonnage sont le reflet de l’efficacité (E) de la RTQ-PCR. L’équation de la phase exponentielle de la PCR permet de démontrer qu’une pente de -1/log2 (=-3,32) correspond à une efficacité de 1. C’est la pente idéale de la droite d’étalonnage. Cette droite permet, par interpolation, de quantifier de l’ADNc et donc l’ARNm présent dans l’échantillon testé.

Figure 14: Cinétique en temps réel d’une réaction PCR (d’après Tse et al., 2003). 2.2.3.2 Méthode

La première étape a commencé par la validation des amorces en faisant une RTQ-PCR sur une série de 7 dilutions d’ADNc des échantillons exprimant le gène d’intérêt. La dilution 1 comprenant 4µl pool d’ADNc, 28µl d’eau. Les dilutions respectives étant 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512. Ces dilutions ont permis la constitution d’une courbe d’étalonnage de la réaction inverse entre les valeurs de Ct et les logarithmes des concentrations en ADNc. Elles permettent de choisir celles dont l’efficacité de la réaction de

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RTQ-PCR est entre 95% et 105%. Les amorces sens et anti-sens ont été choisies en utilisant le programme Primer3 pour rattus norvegicus et validées pour la préproendotheline-1 (PPET1), l’enzyme de conversion de l’endothéline 1 (ECE-1), les récepteurs de l’endothéline de type A (ETA) et B (ET-B), la synthétase endothéliale de l’oxyde nitrique (eNOS), la synthétase inductible de l’oxyde nitrique (iNOS), le récepteur de la protéine de la morphogenèse osseuse de type 1A (BMPR1A) et type 2 (BMPR2), (BMP)4 et (BMP)7, les antagonistes de BMP : gremlin1 et noggin; l’inhibiteur de l’ADN de liaison (Id1), Bax, Bcl-2, l’ATPase calcique du réticulum sarcoplasmique/endoplasmique (SERCA-2A) et l’hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) qui a été utilisée comme gène de ménage. Les séquences des amorces figurent dans le Tableau 6.

Protocoles 1 et 2. Amorces sense et anti-sense utilisées pour l’analyse RTQ-PCR dans les poumons et cœurs des rats

Genes Sequences des amorces

Protéine de morphogenèse osseuse de type 4 (BMP4)

Sense Antisense

5' - CCATCACGAAGAACATCTGG - 3' 5' - GGATGCTGCTGAGGTTAAAGA - 3'

Protéine de morphogenèse osseuse de type 7 (BMP7) Sense Antisense 5’ - GCCCTTCCTTTCCGTTCTATT - 3’ 5’ - TGAGCAGACATCCTCCTTCC - 3’ Gremlin-1 Sense Antisense 5’ - CCTTTCTTTGCTCTCCCTGA - 3’ 5’ - TTGTCTCCCCACACTCTGAA - 3’ Noggin Sense Antisense 5' - CTGAGGGCATGGTGTGTAAG - 3' 5' - GGAAATGATGGGGTACTGGA - 3'

Récepteur de la protéine de morphogenèse osseuse de type 2 (BMPR2)

Sense Antisense

5’ - ATTGAGGGTGGGGTGGTAGT - 3’ 5’ - GTGAAACAAGGGTGCTGGTC - 3’

Récepteur de la protéine de morphogenèse osseuse de type 1A (BMPR1A)

Sense Antisense

5’ - ATCGTCTCTAACCGCTGGAA - 3’ 5’ - CTGTGAGTCTGGATGCTGGA - 3’

Inhibiteur de la protéine de liaison ADN (Id1) Sense Antisense

5’ - CATGAACGGCTGCTACTCAC - 3’ 5’ - TGCAGTATCTCCACCTTGCTC - 3’

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TABLEAU 6. Séquences des amorces sense et antisense.

Pour éviter l’amplification inappropriée de l’ADN génomique résiduel, les amorces ont été choisies sur des exons différents. Une analyse a été faite pour vérifier si les amorces ne reconnaissaient que la séquence d’intérêt.

Méthode de RTQ- PCR

L’expérience de RTQ-PCR est réalisée sur une plaque de 96 puits. Chaque puits contient 8,5µl d’échantillon d’ADNc en présence de 2µl de l’amorce sense, 2µl de l’amorce antisense, 12,5

Antisense 5’ - TCACGGAGGAAGTCCAGTGT - 3’

Bcl-2 Sense

Antisense

5’ - GTGGACAACATCGCTCTGTG - 3’ 5’ - CATGCTGGGGCCATATAGTT - 3’

Calcium-ATPase du réticulum endoplasmique (SERCA-2A) Sense Antisense 5’ - GCAGGTCAAGAAGCTCAAGG - 3’ 5’ - CTCGATCACAAGTTCCAGCA - 3’ Hypoxanthine phosphoribosyltransferase1 (HPRT1) Sense Antisense 5’ - ACAGGCCAGACTTTGTTGGA - 3’ 5’ - TCCACTTTCGCTGATGACCAC - 3’

Pré-proendothéline -1 (PPET-1) Sense

Antisense

5' - CAGACCAAGGGAACAGATGC - 3' 5' - ACGCCTTTCTGCATGGTACT - 3'

Enzyme de conversion de l’endothéline 1 (ECE1) Sense Antisense

5’ - GCCCACCAAGAACGAGATT - 3’ 5’ - GACCCCGATACCAAAGT - 3’

Récepteur de l’endothéline de type A (ETA) Sense Antisense

5’ - CTGGTGGCTCTTTGGATTCT- 3’ 5’ - GCTCCCATTCCTTCTGTTGA- 3’

Récepteur de l’endothéline de type B (ETB) Sense Antisense

5’ - CGATTGTATCATGCCTCGTG- 3’ 5’ - GGGACCATTTCTCATGCACT- 3’

Synthétase endothéliale de l’oxyde nitrique (eNOS)

Sense Antisense

5’ - GGTATTTGATGCTCGGGACT - 3’ 5’ - TGATGGCTGAACGAAGATTG - 3’

Synthétase inductible de l’oxyde nitrique (iNOS) Sense Antisense

5’ - GTTTCCCCCAGTTCCTCACT- 3’ 5’ - CTCTCCATTGCCCCAGTTT- 3’

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µl de tampon Master Mix (SYBR Green PCR Master Mix, Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA) et 16,5µl d’eau dans chaque puits. Un contrôle négatif est fait en remplaçant l’échantillon par de l’eau RNAse free, ceci permet d’identifier s’il existe une contamination dans le mélange. L’amplification a été faite en utilisant l’appareil à RTQ-PCR iCycler System (BioRad Laboratories, Nazareth Eke, Belgium). Pour chaque échantillon, la réaction d’amplification a été réalisée en triplicat. La quantification relative a été obtenue avec la méthode comparative 2^-ΔΔCt par la normalisation avec le gène de ménage (HPRT1). Les résultats ont été exprimés par rapport à la valeur moyenne de l’expression génique relative du groupe contrôle fixé arbitrairement à 1. L’analyse des résultats est basée sur les comparaisons des valeurs de ΔCt (Ct gène d’intérêt-Ct gène de référence HPRT1). La quantification relative de l’expression des gènes d’intérêt fait appel au calcul des ΔΔCt (ΔCt échantillon-ΔCt calibrateur), avec un échantillon contrôle choisi aléatoirement comme calibrateur. La quantité d’ADNc du gène d’intérêt, et donc d’ARNm normalisée par rapport à la référence et relative au calibrateur est donnée par la formule: 2^-ΔΔCt (Winer et al., 1999).

2.3 Caractérisation de l’expression des protéines