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ROMAIN GARY :
Os resultados apresentados a seguir referem-se aos cultivos em batelada alimentada utilizando como alimentação somente o meio de cultura SF900II SFM (Gibco). E comparados com os cultivos em batelada alimentada já apresentados e com os cultivos em batelada em baixa MOI.
A Figura 5.6 mostra o três perfis de crescimento do processo de infecção em batelada- alimentada utilizando como alimentação somente meio de cultura SF900II SFM (Gibco). Pode-se observar que as células infectadas cresceram até uma concentração de (2,60±0,13)x106células viáveis/mL, momento no qual foi realizada a alimentação com meio SF900II SFM (Gibco) fresco (TOF – tempo de alimentação = (2,60±0,13)x106 células viáveis/mL). Esta adição da solução de alimentação proporcionou, assim como na infecção anterior, uma diluição de 50% do volume final da suspensão. Após a alimentação com o meio SF900II SFM (Gibco), as células ainda cresceram até a concentração de (1,67±0,27)x106 células viáveis/mL e subsequente declínio caracterizando a infecção.
Esta estratégia de alimentação é utilizada normalmente quando se deseja realizar um processo de low moi, ou seja, diluição da suspensão celular com o próprio meio de cultura para atingir a mesma produtividade específica observada em altas concentrações de células (MENA et al., 2010).
0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 6 7 TOI TOF C é lu la s V iá v e is x 1 0 6 /m L Tempo (dia) Células não infectadas
Células infectadas sem alimentação Células infectadas com alimentação
Figura 5.6 Cinética da infecção com vAgEGT∆-LacZ em batelada-alimentada (meio de cultura)
A Figura 5.7 apresenta a produção de OB para o cultivo em batelada alimentada utilizando somente o meio SF900II SFM (Gibco) como solução de alimentação. A produção de corpos de oclusão foi muito baixa em relação aos demais processos de infecção, obtendo- se apenas em média (5,0±0,80)x106OB/mL em 8 dpi e uma relação muito pequena de OB/Célula em média 3,33 ±0,53. Portanto, apresentando uma produção volumétrica média de OB cerca de 6 vezes menor do que o cultivo em batelada alimentada utilizando a solução de nutrientes associada ao meio de cultura e cerca de 10 vezes menor do que a produção utilizando somente a solução de nutrientes como fonte de alimentação.
2 3 4 5 6 7 8 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 Tempo (dia) O B x 1 0 6 /m L 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 Produção volumétrica de OB Produção específica de OB O B /C é lu la
Figura 5.7 Perfil de produção de OB com alimentação (meio de cultura)
Comparando a produção específica de OB, observa-se que a produção utilizando o somente o meio de cultura SF900II SFM (Gibco) como solução de alimentação não apresentou diferença quando comparada com o sistema de produção em batelada, provavelmente essa produção poderia ter apresentado melhores resultados se fosse realizada outra adição de meio de cultura proporcionando mais uma diluição (50% v/v) e consequentemente, o estabelecimento da infecção ocasionando maior produção específica provocada pela baixa multiplicidade de infecção (low moi) sequenciada, fato observado no estudo de Mena et al. (2010).
A produção observada nesta condição de alimentação (somente com meio de cultura) foi cerca de 5 vezes menor do que a produção em batelada alimentada utilizando a solução de
nutrientes associada ao meio de cultura como fonte de alimentação e cerca de 10 vezes menor do que a produção em batelada alimentada utilizando a solução de nutrientes como única fonte de alimentação. Tal diferença significativa foi ocasionada pela composição das soluções de alimentação adicionadas na batelada-alimentada.
5.4 Conclusão
A produção in vitro do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ utilizando o sistema de cultivo em batelada-alimentada associado com a baixa MOI e utilizando como solução de alimentação somente os nutrientes (aminoácidos, lipídeos, yeastolate, glicose, glutamina) obteve uma produção de corpos de oclusão ((5,30±0,85)x107OB/mL) 3 vezes maior do que a infecção utilizando somente baixa MOI ((1,83±0,29)x107OB/mL). A fonte de nutrientes permitiu que as células viáveis permanecessem mais tempo sadias e consequentemente, com maior capacidade de produção de produção de OB, devido ao estabelecimento da infecção em sincronismo.
O processo de infecção em batelada-alimentada utilizando como solução de alimentação com nutrientes suplementados com meio SF900II SFM (Gibco) apresentou uma produção ((3,20±0,51)x107OB/mL) cerca de 2 vezes maior quando comparada ao processo de infecção em batelada ((1,83±0,29)x107OB/mL), portanto, a estratégia de adicionar o meio de cultura aos nutrientes não favoreceu o aumento da produção de OB.
Com a adição somente do meio a produção foi bem menor ((5,0±0,80)x106OB/mL) não apresentando uma produção volumétrica significativa e uma produção específica mínima de cerca de 3,0±0,48 OB/Célula em 8 dias de infecção.
Capítulo 6
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6 Conclusão Geral
A produção in vitro de baculovirus recombinante vAgEGT∆-LacZ é desejável pois este baculovírus por apresentar o gene egt de forma silenciada proporciona diminuição no tempo de vida do inseto e por ser mais agressivo do que o selvagem AgMNPV desperta interesse na sua produção em larga escala para produção de bioinseticida viral. Os resultados de produção apresentaram grande potencial quanto à replicação em células Sf21. Durante o estudo da multiplicidade de infecção constatou-se que o baculovírus recombinante vAgEGT∆-
LacZ necessitaria de quantidades inferiores de inóculo viral nas infecções quanto comparado
com o baculovírus selvagem, comprovando a sua maior agressividade nas células hospedeiras. As passagens sucessivas do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ
demonstraram estabilidade viral ao longo do processo de infecção uma vez que houve aumento da produção de OB, produção média de 18,87 ± 3,02 para 46,02 ± 7,36 OB/Célula ao longo do cultivo, proporcionando um aumento de 59% na sua produção, fato que normalmente não é observado em sistemas de cultivo em células de inseto, pois o que geralmente acontece é uma rápida diminuição de OB ao longo do cultivo.
Em vista disto, a ampliação de escala proposta neste trabalho, associando o sistema de bateladas sucessivas ao processo de produção em passagem seriada, considerando que cada batelada fosse um reator, e esse reator fosse o inóculo do reator subsequente, apresentou resultados animadores quanto ao processo em larga escala, onde em somente 5 passagens virais obteve-se uma produção de 8,9x1014 corpos de oclusão. A demanda nacional é de 1,5x1011OB/hectare de área tratada com o baculovírus AgMNPV e considerando que são tratados cerca de 1,6 milhão de hectares/ano, então são necessários 253 sistemas de cultivos do tipo bateladas repetidas com 5 passagens cada para atender a demanda de mercado. Outra característica interessante desse recombinante é a sua capacidade de produção de OB quando comparada com o baculovírus selvagem AgMNPV-MP5, que em mesmas condições de cultivo apresentou uma produção de OB semelhante ao baculovírus selvagem, identificando assim o potencial de produção de OB do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ em células Sf21 utilizando o sistema de cultivo em suspensão.
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E ainda, comparando as estratégias de produção (batelada e batelada-alimentada) visando o aumento de produção de OB do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ conclui- se que o processo em batelada alimentada utilizando somente a solução de nutrientes (aminoácidos, lipídeos, yeastolate, glicose, glutamina) apresentou o melhor resultado de produção de corpos de oclusão, proporcionando um aumento da produção de três vezes (5,3x107OB/mL) em relação ao processo em batelada (1,83x107OB/mL). Tornando a estratégia de batelada alimentada, já muito difundida na produção de proteínas utilizando o sistema de vetor de expressão em baculovírus, uma alternativa de melhoria também na produção de bioinseticida viral.
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