Jusqu'à!présent,!différentes!études!ont!montré!que!la!réplication!du!HCV!est!très!sensible! aux! siRNA! ciblant! l’ARN! viral.! En! effet,! le! génome! de! celui"ci! étant! un! ARN! simple! brin! positif! jouant! le! rôle! d’ARN! messager,! il! constitue! une! cible! intéressante! pour! le! développement! de! thérapies! basées! sur! l’ARN! interférence278.! Ainsi,! différentes! études! ont! montré! que! les! siRNA!
ciblant!directement!différentes!parties!de!l’ARN!viral!comme!la!région!5’UTR,!la!protéine!Core! ou! les! protéines! non"structurales,! permettaient! une! diminution! importante! de! la! réplication! virale279.!Parmi!celles"ci,!un!résultat!intéressant!montre!que!le!ciblage!de!l’IRES!du!virus!grâce!au!
siRNA!siHCV331!permet!d’inhiber!à!la!fois!la!réplication!virale!et!la!production!des!différentes! protéines280.!
Grâce!à!l'existence!de!différents!guides!et!algorithmes,!le!design!et!la!synthèse!de!siRNA! sont! relativement! aisés,! contrairement! aux! petites! molécules! inhibitrices.! De! plus,! la! disponibilité!de!banques!de!séquences!génomiques!permet!le!design!de!siRNA!très!spécifiques,! permettant!de!diminuer!les!effets!off8target!indésirables.!
Autre!avantage!non!négligeable,!Dicer!et!RISC!sont!situés!et!agissent!dans!le!cytoplasme,! évitant!ainsi,!contrairement!à!d’autres!techniques,!la!nécessité!d’entrer!dans!le!noyau.!De!plus,! l’ARN! interférence! est! un! processus! existant! déjà! dans! les! cellules.! Ainsi,! aucune! toxicité! engendrée!par!l’introduction!d’un!corps!étranger!n’est!à!déplorer.!!
La! durée! d’effet! de! l’ARN! interférence! est! à! la! fois! un! avantage! et! un! inconvénient.! En! effet,! l’inhibition! d’expression! génique! engendrée! ne! se! maintient! que! sur! une! durée! relativement! courte,! ce! qui! diminue! les! risques! d’effets! secondaires,! contrairement! à! d’autres! méthodes.!Cette!rémanence!limitée!entraîne!cependant!la!nécessité!de!renouveler!régulièrement! le!traitement.!!
De!la!même!manière!que!pour!différentes!autres!thérapies,!l’un!des!écueils!principaux!à! l’utilisation! de! RNAi! est! la! particularité! de! certains! virus! à! ARN! de! développer! des! mutations! leur! permettant! d’échapper! au! traitement,! grâce! à! l’absence! de! fonctions! de! relecture! de! leur! polymérase.!Pour!limiter!au!maximum!cet!inconvénient,!le!choix!des!cibles!est!très!important!:! certaines!régions!du!génome!viral,!telles!que!l’IRES,!sont!des!régions!hautement!conservées.!En! effet,!le!maintien!de!ces!séquences!est!indispensable!à!la!réplication!virale.!Outre!le!ciblage!de! ces! régions! très! conservées,! l’utilisation! d'un! pool! de! siRNA! pour! cibler! simultanément! différents!sites!est!également!une!approche!intéressante.!
Enfin,!comme!nous!l’avons!vu!précédemment,!l’importance!des!facteurs!de!l’hôte!dans!le! cycle!viral!permet!également!d’envisager!de!cibler!ces!protéines!très!conservées.!Il!est!toutefois! important! de! prendre! garde! à! ne! pas! modifier! des! fonctions! indispensables! au! bon! fonctionnement!cellulaire.!
"!66!"!
2. Carcinome)hépatocellulaire)(HCC))et)autres)tumeurs)
Environ!80!%!des!cas!de!HCC!sont!dus!au!HCV!et/ou!au!virus!de!l’hépatite!B!(HBV)281.! Chaque!année,!plus!de!250!000!cas!de!HCC!sont!diagnostiqués,!et!on!estime!le!nombre!de!décès! associé!à!500!000!à!600!000,!avec!malheureusement!une!incidence!croissance!de!cas.!En!Afrique! et!en!Asie,!60!%!des!cas!sont!associés!au!HBV,!celui"ci!y!étant!endémique,!20!%!au!HCV,!et!20!%! à!différents!autres!facteurs!de!risque!(alcool,!etc).!Dans!le!reste!du!monde!par!contre,!ces!chiffres! sont!inversés,!avec!plus!de!60!%!de!relation!HCV/HCC282.!Pathogénèse#du#HCC#
Influence!virale!Le! HCC! virus"induit! survient! dans! un! environnement! propice! au! développement! de! dommages! hépatiques! chroniques! (inflammation! et! régénération).! HCV! et! HBV! n’étant! pas! majoritairement!cytopathiques,!il!est!possible!que!la!réplication!virale!constante!soit!un!facteur! de!risque!de!HCC,!l’inflammation!pouvant!conduire!au!développement!de!maladies!hépatiques! chroniques!(CLD,!chronic!liver!diseases)283.!En!effet,!les!virus!produisent!des!protéines!qui!vont!
émousser! la! mise! en! place! de! réactions! immunitaires! contre! ces! infections! chroniques!:! de! nombreuses! cellules! immunitaires! non"spécifiques! cellules! NK,! NKT,! polynucléaires)! sont! retrouvées! dans! les! lésions,! celles"ci! sont! incapables! d’engendrer! une! clairance! virale281.! De! la!
même!façon,!le!déséquilibre!cytokinique!pourrait!également!ralentir!l’élimination!du!virus.!! Outre!le!ralentissement!de!la!réponse!immunitaire,!les!protéines!virales!vont!également! modifier!l’expression!génique!et!le!phénotype!cellulaire!de!l’hôte,!évènements!caractéristiques! des!cancers.!Les!cellules!vont!alors!proliférer!de!façon!indépendante!des!facteurs!de!croissance,! et!sans!obéir!aux!signaux!inhibant!la!croissance,!modifier!leur!métabolisme!énergétique,!devenir! métastatiques! et! envahir! les! tissus! alentours.! De! même,! les! cellules! vont! devenir! résistantes! à! l’apoptose!et!insensibles!aux!attaques!du!système!immunitaires!ou!de!tout!traitement284.!!
Modifications!anatomiques!et!cellulaires!conduisant!au!développement!du!HCC285!!
Lors!du!développement!du!HCC,!différentes!étapes!peuvent!être!observées!:!!
! Parenchyme) hépatique) sain.! Hépatocytes! présentant! des! microvillosités,! et! cellules! endothéliales! sinusoïdales! dont! les! fenestrations! favorisent! les! échanges! métaboliques.! Quelques!cellules!étoilées!hépatiques!(cellules!de!Ito),!contenant!des!gouttelettes!lipidiques! se!situent!dans!l’espace!de!Disse!(péricapillaire)(Illustration!III"5A).!
! Foie) fibrotique.! En! cas! de! CLD,! les! hépatocytes! perdent! leurs! microvillosités,! les! cellules! endothéliales! sinusoïdales! perdent! leurs! fenestrations,! tandis! que! les! cellules! étoilées!
hépatiques! sont! activées,! perdent! leurs! gouttelettes! lipidiques,! et! sécrètent! de! la! matrice! extracellulaire!(ECM)(Illustration!III"5B).!!
! HCC.!Les!hépatocytes!deviennent!malins,!leur!croissance!n’est!plus!contrôlée.!Infiltration!de! cellules!inflammatoires!et!de!cytokines!;!fibrose!importante,!et!recrutement!de!fibroblastes! associés!aux!tumeurs!(TAF)!et!de!cellules!souches!cancéreuses!(CSC)(Illustration!III"5C).! ! Développement! de! nouveaux! vaisseaux! sanguins! (néoangiogénèse)! et! métastases!
(Illustration!III"5D).! ! Illustration)IIIY5):)Modifications)anatomiques)et)cellulaires)conduisant)au)HCC.) (Source):)HernandezYGea,)2013285))
Traitements#du#HCC##
Si!des!traitements!existent,!la!plupart!ne!sont!pas!adaptés,!et!la!mortalité!est!élevée.!Les! tumeurs! les! plus! petites! et! isolées! sont! retirées! chirurgicalement,! mais! les! récidives! sont! courantes286.!Les!chimiothérapies!et!radiothérapies!n’ont!qu’un!succès!limité,!car!ils!ne!sont!pas!healing response of the liver and undoubtedly beneficial in the short-term, perpetuates chronic injury. Chronic inflammation drives a maladaptive reparative reaction and stimulates liver cell death and regeneration, which is eventually associated with the development of dysplastic nodules and cancer (Figure 3).
Several inflammatory mediators have been implicated in sustained inflammation and immunosuppression asso- ciated with development of HCC. Carcinogenesis is asso- ciated with persistent cytokine production that can stim- ulate many liver cell types with a variety of unique as well as redundant interactions. Altered cytokine profiles have been described in HCC not only in tumor cells but also in
the surrounding tissue; however, the full portrait of their mechanistic role remains unclear. A predominant role of the Th2-like (interleukin [IL]-4, IL-8, IL-10, and IL-5) cytokine compared with Th1-like (IL-1!, IL-1", IL-2, tu- mor necrosis factor!) cytokine in the microenvironment has been associated with a more aggressive and metastatic HCC phenotype.40,41IL-6 is an abundant cytokine in cir-
rhotic livers, produced by Kupffer cells in response to hepatocyte damage, and a potent activator of STAT3, and elevated levels in serum are associated with risk of HCC and poor prognosis.10,42 Moreover, modulation of the
inflammatory microenvironment by suppression of HGF and IL-6 production by estrogens represses metastasis of
Figure 3. Anatomic and cellular alterations leading to the devel- opment of HCC. (A) Normal liver parenchyma. Hepatocytes with microvilli and sinusoidal endo- thelial cells whose fenestrations favor metabolic exchange. Space of Disse with few quiescent stel- late cells containing lipid drop- lets. (B) Fibrotic liver. Upon chronic liver injury, hepatocytes lose their microvilli, sinusoid en- dothelial cells become defenes- trated, and stellate cells are acti- vated, losing lipid droplets and secreting ECM. (C) HCC. Malig- nant transformation of hepato- cytes with uncontrolled growth. Infiltration of inflammatory cells and cytokines with extensive fi- brosis and recruitment of TAFs and CSCs. (D) Development of new vessels (neoangiogenesis) and distant metastases.
REVIEWS
AND
PERSPECTIVES
"!68!"!
suffisamment!spécifiques,!et!certaines!voies!stimulant!la!croissance!tumorale!en!compensent!les! effets.!!
L’utilisation!de!l’inhibiteur!multi"kinases!Sorafenib!a!permis!de!prolonger!la!survie!des! patients!d’environ!un!trimestre!:!c’est!la!première!fois!que!le!ciblage!d’une!voie!moléculaire!du! HCC! permet! d’augmenter! la! survie! des! patients281.! D’autres! thérapies! ciblant! des! voies!
spécifiques!du!HCC!sont!en!cours!d’études287.!Il!faudra!cependant!encore!un!certain!temps!avant!
que!ces!thérapies!puissent!être!utilisées!en!clinique.!!
L'une! des! principales! difficultés! pour! le! développement! de! thérapie! ciblant! les! biomarqueurs!du!HCC!vient!de!la!mauvaise!connaissance!de!la!pathogenèse!de!la!tumeur,!et!de! l’extrême!variabilité!des!marqueurs!parmi!les!patients.!Ainsi,!plus!de!50!drogues!et!environ!200! essais! cliniques! sont! en! cours! d’étude,! mais! les! voies! moléculaires! utilisées! lors! du! développement! du! HCC,! notamment! pour! le! HCC! HCV"induit,! ne! sont! pas! clairement! déterminées! pour! l'instant.! C'est! pourquoi,! pour! l’instant,! il! est! important! de! cibler! des! voies! généralement!impliquées!dans!le!développement!oncogénique!de!manière!générale.! Etant!donné!l’hétérogénéité!du!HCC,!en!fonction!des!différents!sous"groupes!de!patients! et!selon!leur!profil!de!biomarqueurs,!il!sera!probablement!nécessaire!d’utiliser!des!traitements! sous!forme!de!cocktails,!ciblant!conjointement!différentes!voies.!Dans!ce!contexte,!l’utilisation!de! l’interférence!ARN!semble!être!une!alternative!pour!le!moins!intéressante.!
Modèles#d’étude#des#tumeurs#in)vitro):#sphéroïdes)
Avantages!des!sphéroïdes!comparés!aux!cultures!en!2D!La! majorité! des! cultures! de! cellules! et! des! expériences! in# vitro# sont! réalisées! en! «!monocouche!»!sur!du!polystyrène!compatible,!modèle!très!éloigné!de!la!réalité!physiologique.! En! effet,! dans! le! corps,! les! cellules! sont! soit! en! contact! direct! avec! d’autres! cellules! de! lignées! identique!ou!différentes,!soit!en!contact!avec!la!matrice!extracellulaire!(ECM).!Si!cette!approche! présente!de!nombreux!avantages!(contrôle!de!l’environnement,!manipulation!aisée,!etc.),!elle!ne! peut!cependant!pas!être!considérée!comme!présentant!un!microenvironnement!naturel!pour!les! cellules,! contrairement! aux! cultures! 3D288.! En! effet,! dans! cette! configuration,! les! cellules! sont!
cultivées! sur! des! matériaux! de! soutien! en! 3D289,! en! inclusion! dans! des! gels290,! ou! encore! sous!
forme! d’agrégats! (nommés! mammosphères291,! micromasses292,! tissus! microfabriqués293,! ou!
encore! sphéroïdes294).! Nous! avons! choisi! d’utiliser! le! terme! de! sphéroïdes! car! il! nous! semble!
plus!imagé!et!exprimant!mieux!l’absence!de!tout!substrat!de!culture.!!
Les! cellules! cultivées! dans! un! environnement! 3D! se! comportent! de! manière! fondamentalement! différente! des! cellules! cultivées! en! «!monocouche!».! Par! exemple,! le!
phénotype!naturel!des!hépatocytes!va!rapidement!disparaître!une!fois!sortis!de!l’organisme!et! mis!en!culture!«!traditionnelle!»295.!La!plupart!des!modifications!observées!sont!principalement! dues!à!la!différence!entre!les!interactions!cellules"cellules!et!cellules"matrice!selon!le!système!de! culture.! ! Illustration)IIIY6):)Production)de)sphéroïdes.) (Source):)Fennema)et#al.,)2013288)) Il!existe!différentes!méthodes!pour!produire!des!sphéroïdes!:! ! Culture!de!cellules!en!suspension/recouvrement!liquide!:!les!agrégats!cellulaires!se!forment! en! suspension! en! brassant! de! grands! volumes! de! milieu! de! culture.! C'est! une! solution! intéressante! pour! une! production! de! masse,! mais! elle! ne! permet! pas! pour! l’instant! de! contrôle!précis!de!la!taille!des!agrégats!(Illustration!III"6a)296.!
! Culture! en! gouttes! suspendue!:! les! cellules,! une! fois! mises! en! suspension! dans! une! goutte! suspendue!à!une!plaque!retournée,!forment!un!agrégat!de!manière!spontanée!(Illustration! III"6b).!C’est!la!première!technique!a!avoir!été!répertoriée297.!De!nouvelles!plateformes!en!96!
et! 384! puits! permettent! de! former! des! agrégats! plus! petits! et! de! taille! mieux! contrôlée! (Illustration!III"6c)298.!
replication of a complex tissue environment are cartilage tissue[27], pancreatic tissue[28], and cardiac muscle[29]. More recent examples include the formation of organs such as the pituitary gland[30], optic cup[31], and layered cortical tissue[32]. We provide examples that are indica- tive of the possibilities for engineering complex tissues either for regeneration or basic biological research when using spheroid culture.
Tissue engineering constructs are limited in size be- cause they generally lack a vascular network. This results in inadequate distribution of oxygen and nutrients to the implanted construct and limited integration with the host.
A possible answer to this problem is the in vitro pre- vascularization of grafts[6,33,34](Figure 1). Vasculariza- tion is a 3D process in which vascular structures develop within another tissue. This makes coculture of spheroids an interesting model system for vascularization, because the dense cellular environment combined with the pres- ence of natural ECM and the possibility to include support- ing cells such as mesenchymal precursors, offer a good resemblance of the natural environment in which vascu- larization takes place. Apart from tissues such as liver, muscle, and cardiac tissue[35], spheroids have been used to engineer prevascularized bone[6]. Blood vessels form in
(a) (c) (b) (d) (f) (e) PDMS PDMS Agarose Agarose Agarose Silicone PDMS channel PDMS channel Polycarbonate membrane TRENDS in Biotechnology
Figure I. Spheroid fabrication methods: (a) liquid overlay technique; (b) hanging drop technique; (c) microwell hanging drop technique; (d) microwell array from micropatterned agarose wells; (e,f) microfluidic spheroid formation. [(e) is adapted from[75]).
Review Trends in Biotechnology February 2013, Vol. 31, No. 2
"!70!"!
! Technique! en! micropuits!:! les! agrégats! se! forment! dans! des! plaques! 96"puits! à! fond! rond! non"adhérentes.! Il! existe! également! de! nouvelles! plateformes! avec! davantage! de! puits! à! l’échelle!micrométrique,!ou!encore!des!tampons!permettant!d’imprimer!aisément!en!routine! des!puits!dans!de!l’agarose!(Illustration!III"6d)299,300.!
! Microfluidique!:! des! canaux! microfluidiques! permettent! la! formation! d’agrégats! cellulaires.! Grâce!à!cette!méthode,!une!production!en!continu!d’agrégats!de!taille!contrôlée!pourrait!être! mise!en!place!(Illustration!III"6e,f)301.!!