Principe!
La!réaction!de!polymérisation!en!chaîne!(polymerase!chain!reaction,!PCR)!quantitative! en! temps! réel! (qRT"PCR)! est! une! technique! utilisée! depuis! plus! de! 20! ans! pour! évaluer! une! quantité! d’ADN! ou! d’ARN,! si! la! qRT"PCR! est! précédée! par! une! transcription! réverse,! afin! d’obtenir! l’ADN! complémentaire.! Comme! lors! d’une! PCR! classique,! le! double! brin! d’ADN! est! séparé! par! augmentation! de! la! température,! permettant,! lors! de! la! diminution! de! celle"ci! la! fixation!de!primers!complémentaires!sur!l’ADN,!et!la!synthèse!des!brins!complémentaires!grâce! à!une!ADN"polymérase.!La!spécificité!de!la!qRT"PCR!est!la!fixation!dans!le!même!temps!d’une! sonde!ADN!complémentaire!d’une!séquence!située!entre!les!deux!primers.!Cette!sonde!comporte! à! une! extrémité! un! fluorophore,! et! à! l’autre! extrémité! un! «!quencher!»,! absorbant! l’énergie! lumineuse!émise!par!le!fluorophore!lorsque!celui"ci!est!à!proximité.!Lors!de!la!synthèse!du!brin! complémentaire,!la!polymérase,!grâce!à!son!activité!exonucléasique,!détruit!la!sonde,!éloignant! le!fluorophore!du!quencher,!et!lui!permettant!de!fluorescer!en!présence!d’une!source!lumineuse.! Chaque!cycle!de!PCR!va!permettre!la!production!d’un!nouveau!brin!d’ADN,!et!donc!la!libération! d’un! fluorophore! supplémentaire,! et! ce! de! manière! exponentielle,! chaque! brin! d’ADN! servant! ensuite! de! guide! pour! la! synthèse! du! brin! suivant.! Ainsi,! la! quantité! d’ADN,! de! même! que! la! fluorescence,!double!à!chaque!cycle.!!
L’appareil! de! qRT"PCR! détermine! un! seuil! de! détection! de! la! fluorescence.! Le! dépassement!de!ce!seuil!par!la!fluorescence!d’un!échantillon!donne!accès!au!nombre!de!cycles! ayant!permis!d’atteindre!celui"ci,!ce!qui!permet!ainsi!de!déterminer!la!quantité!initiale!d’ADN!à! l’aide!d’une!courbe!étalon,!réalisée!en!effectuant!en!parallèle!à!l’expérience!une!qRT"PCR!sur!une! série! de! dilutions! connues.! A! partir! de! ces! données,! l’appareil! de! qRT"PCR! peut! calculer! la! quantité!initiale!d’ADN!présente!dans!chaque!échantillon.!
La!qRT"PCR!sur!siRNA!
L’utilisation!de!l’ARN!interférence,!ainsi!que!la!recherche!de!nouveaux!vecteurs!de!siRNA! dans! les! cellules,! ont! engendré! le! besoin! de! trouver! une! technique! capable! de! déterminer! la! quantité!de!siRNA!réellement!présente!dans!les!cellules,!et!donc!l’efficacité!du!vecteur!et!de!la! transfection!des!siRNA.!Parmi!d’autres!méthodes,!la!qRT"PCR!est!apparue!comme!une!technique! des!plus!intéressantes,!notamment!de!par!sa!sensibilité!et!sa!fiabilité313.!Son!utilisation!dans!le!
domaine!de!l’ARN!interférence!est!en!constante!augmentation!depuis!ses!débuts,!il!y!a!5!ans.!La! qRT"PCR!sur!petits!ARN!fonctionne!sur!le!même!principe!que!la!qRT"PCR!classique,!mais!avec! des! primers! créés! spécifiquement! pour! ce! type! de! molécules,! notamment! un! primer! de!
"!92!"! transcription!réverse! présentant!une!structure!en!épingle!à!cheveux,!particulièrement!efficace! avec!les!petits!ARN314.!! Illustration)IIY7):)qRTYPCR.) (Source):)life)technologies)) Déroulement!d’une!expérience!! Les!PHH!sont!mises!en!plaque!48!puits!à!raison!de!2.105!cellules!par!puits.!Le!milieu!de! culture!est!changé!après!24!h.!Environ!36!h!après!la!mise!en!plaque,!des!CPnp(PEIPyr/siRNA)2,5!
sont! ajoutées! dans! le! milieu! de! culture,! enrobées! avec! siLuc! ou! siCTRL.! A! différents! temps,! le! milieu!de!culture!est!retiré,!les!PHH!sont!lavés!au!PBS,!et!lysés!par!ajout!de! 350!µL!de!QIAzol! Lysis!Reagent,!et!congelées.!!
L’ARN!est!ensuite!extrait!du!lysat!des!PHH!à!l’aide!du!kit!miRNeasy!Mini!(Qiagen).!Les! lysats!sont!incubés!5!min!à!température!ambiante,!puis!additionnés!de!70!µL!de!chloroforme!et! vortexés! 15!s.! Après! 3!min! supplémentaires! d’incubation,! les! lysats! sont! centrifugés! 15!min! à! 12000!g! et! à! 4!°C! afin! de! séparer! la! phase! supérieure! aqueuse! contenant! le! chloroforme,! et! l’ARN,! de! la! phase! contenant! le! phénol! du! tampon! de! lyse.! La! phase! aqueuse! est! récoltée,! et! transférée!dans!un!nouveau!tube,!et!1,5!volume!d’éthanol!pur!y!est!ajouté!pour!précipiter!l’ARN.! Après!homogénéisation,!le!mélange!est!transféré!sur!une!colonne!RNeasy!Mini!afin!de!purifier! l’ARN.!Ce!dernier!est!lavé!en!trois!étapes!avec!les!tampons!fournis!par!le!kit,!entrecoupées!par!de! brèves! centrifugations! (15!s! à! une! vitesse! supérieure! à! 8000!g),! puis! élué! dans! 30!µL! d’eau! RNase"free! par! centrifugation! 1!min! à! une! vitesse! supérieure! à! 8000!g.! L’ARN! est! ensuite! quantifié!au!Nanodrop,!puis!congelé!à!"20!°C!jusqu’à!son!utilisation.!
L’ADN! complémentaire! est! ensuite! obtenu! par! transcription! réverse! à! l’aide! du! kit! TaqMan®! Small! RNA! assays! (life! technologies)! et! d’un! primer! commercial! spécifique! au! siLuc.! 14
TaqMan® technology goes small with big benefits for
miRNA research
ǩ Highly specific—quantitate only the biologically active mature miRNAs, not precursors—with single-base discrimination of homologous family members (Figure 6)
ǩ Sensitive—requires only 1–10 ng of total RNA or equivalent to conserve limited samples
ǩ Wide dynamic range—up to 7 logs—detect high and low expressors in a single experiment (Figure 7)
ǩ Custom assays available—you specify the sequence, and Life Technologies will design an assay
ǩ Fast, simple, and scalable—two-step real-time RT-PCR assay quickly provides high-quality results
Q F Reverse Transcription Real-Time PCR Stem-loop RT primer Target Sequence Forward Primer TaqMan® probe Reverse primer
Figure 5. TaqMan® MicroRNA Assay approach. A simple two-step process brings the advantages of real-time PCR to miRNA research.
miRNA Assays
Mature miRNAs Precursors
Perfectly matched Ct Mismatched Ct ∆Ct (mismatch vs. match) Ct ∆Ct (Precursor vs. mature) let-7a Looped 16.5 33.1 16.6 29.5 13.0 Linear 23.6 38.3 14.7 30.4 6.8 miRNA Stem-loop RT primer miRNA Linear RT primer
Figure 6. The stem-loop primer strategy for reverse transcription in TaqMan® MicroRNA Assays confers specificity for biologically active mature microRNA. An off-the-shelf TaqMan® MicroRNA Assay for let-7a, containing a stem-loop RT primer, was compared with a comparable-sequence linear RT primer/PCR primer/TaqMan® probe set. Next, 1.5 x 108 copies of synthetic miRNA mimicking mature let-7a, mature let-7e (a closely related miRNA differing at only two base positions), and the stem-loop let-7a precursor were added to RT reactions primed with either the stem- loop TaqMan® MicroRNA Assay RT primer or linear RT primer of comparable sequence. The cDNA was then amplified using real-time PCR. The data indicate that the stem-loop RT primer confers better discrimination between mature versus precursor miRNAs and closely related targets.
L’ARN! est! tout! d’abord! dénaturé! afin! de! séparer! les! doubles! brins! des! siRNA,! et! permettre! la! fixation!du!primer.!Pour!cela,!5!µL!d’ARN,!contenant!1!à!10!ng!d’ARN!total!sont!mélangés!à!3!µL! de!RT!primer,!et!incubés!5!min!à!85!°C,!puis!5!min!à!60!°C.!Les!échantillons!sont!conservés!sur! glace,!et!additionnés!de!7!µL!de!master!mix!contenant!:!! Volumes Produits 0,15 µL 100 mM dNTPs
1,00 µL Réverse Transcriptase MultiScribe™, 50 U.µL-1
1,50 µL Tampon de transcription réverse 10 ✕
0,19 µL Inhibiteur de RNase, 20 U.µL-1
4,16 µL Eau Nuclease-free
Après!avoir!mélangé!et!centrifugé!les!solutions,!elles!sont!incubées!sur!glace!5!min,!puis! insérées! dans! le! thermocycleur! afin! de! réaliser! la! transcription! réverse! selon! le! programme! suivant!:!! Temps Température 30 min 16 °C 30 min 42 °C 5 min 85 °C +∞ 4 °C
Les! échantillons! peuvent! à! nouveau! être! congelés! à! "20!°C! avant! utilisation,! ou! utilisés! directement! pour! la! qRT"PCR,! en! triplicats!:! 1!µL! du! produit! de! transcription! réverse! est! transféré!dans!trois!nouveaux!tubes,!et!additionné!de!18!µL!de!master!mix!composé!de!:!
Volumes Produits
1 µL TaqMan® Small RNA Assay (20 ✕)
10 µL !TaqMan® Universal PCR Master Mix II (2 ✕), no UNG
8 µL Eau Nuclease-free !
Après! avoir! mélangé! et! centrifugé! les! solutions,! elles! sont! placées! dans! le! système! de! détection!Rotor!Gene!6000!(Corbett)!afin!de!réaliser!la!qRT"PCR!selon!le!programme!suivant!:!! Temps Température 10 min 95 °C 40 cycles 15 s 95 °C 60 s 60 °C Pour!pouvoir!analyser!les!résultats!de!la!qRT"PCR,!la!transcription!réverse!ainsi!que!la! qRT"PCR!sont!réalisées!en!parallèle!des!échantillons!sur!une!gamme!0,1!pg!à!10!ng!de!siLuc!seul.! Trois! contrôles! négatifs! sont! également! effectués!:! l’ensemble! des! manipulations! sur! 10!ng! siCTRL!seul,!la!transcription!réverse!ainsi!que!la!qRT"PCR!sur!de!l’eau!nuclease"free,!et!la!qRT" PCR!sur!de!l’eau!nuclease"free,!afin!de!s’assurer!qu’il!n’y!a!eu!de!contamination!à!aucune!étape.!!
Grâce! à! la! gamme! étalon,! le! logiciel! du! système! de! détection! va! pouvoir! établir! une! relation! entre! les! seuils! de! détections! obtenus! et! les! quantités! de! siLuc! de! chaque! point! de! la! gamme.! L’équation! de! la! droite! de! régression! obtenue! permet! de! retrouver! les! quantités! de! siLuc!présentes!dans!chaque!échantillon.!
"!94!"!
Cytométrie#en#flux#
La!cytométrie!en!flux!permet!de!mesurer!les!caractéristiques!(taille,!granularité,!etc.)!de! chaque!élément!d’une!suspension!(bactérie,!cellules,!etc.),!ainsi!que!tout!paramètre!pouvant!être! détecté!par!fluorescence.!Les!éléments!à!analyser!sont!en!suspension!dans!un!flux!liquide!dans! un!capillaire,!afin!de!ne!permettre!le!passage!que!d’un!élément!à!la!fois.!! Un!laser!passe!à!travers!ce!flux,!et!les!signaux!émis!par!chaque!particule!sont!captés!par! des!détecteurs!:!!! La! taille! des! éléments! est! évaluée! par! un! détecteur! aligné! avec! le! laser! (Forward! Scatter,! FSC)!
! Les! éléments! fluorescents! situés! dans! les! cellules! ou! attachés! à! leur! surface,! excités! par! le! laser,! ainsi! que! la! granularité! des! cellules! sont! analysés! par! différents! détecteurs! (Side! Scatter,!SSC)!
! Illustration)IIY8):)Cytométrie)en)flux.)
(Source):)Semrock).)
L’association! des! différents! paramètres! récoltés! par! les! détecteurs,! ainsi! que! l’analyse! des! variations! de! chaque! pic! de! fluorescence! permettent! d’obtenir! diverses! informations! concernant! les! éléments! analysés.! Les! données! obtenues! sont! alors! représentées! sous! forme! statistiques!ou!sous!forme!graphique.!
Evaluation!de!l’expression!de!CD81!
Afin!de!déterminer!l’impact!des!CPnp(PEIPyr/siCD81)2.5!sur!les!cellules!Huh751,!celles"
ci!ont!été!transfectées!avec!les!nanoparticules.!L’expression!de!la!protéine!CD81!a!été!observée!à! différents!temps,!dans!les!cellules!transfectées!et!des!cellules!contrôles!non!transfectées.!!
Pour! cela,! les! cellules! des! deux! conditions! ont! été! détachées! à! 3,! 5,! 7,! et! 9! jours! après! transfection,!à!l’aide!de!trypsine,!après!retrait!du!milieu!et!lavage!au!PBS!pour!éliminer!le!reste! de!sérum!du!milieu,!ce!dernier!pouvant!inhiber!la!trypsine.!Les!cellules!ont!ensuite!été!récoltées! dans!du!milieu,!les!trois!puits!de!chaque!condition!étant!regroupés,!et!centrifugées!à!1500!rpm! pendant!5!min,!comptées,!et!resuspendues!dans!du!PBS!à!environ!2,5.106!cellules.mL"1.!100!µL!
de! chaque! suspension! ont! été! déposés! dans! une! plaque! 96!puits! à! fond! en! V,! permettant! de! culotter! aisément! les! cellules! par! centrifugation! et! d’éliminer! le! surnageant! en! retournant! la! plaque.! Les! cellules! ont! été! centrifugées! à! 1500!rpm! pendant! 5!min,! et! après! retrait! du! surnageant,!et!les!cellules!ont!été!resuspendues!dans!50!µL!de!PBS!seul!ou!de!PBS!contenant!des! anticorps! murins! spécifiques! anti"CD81! (5A6)! (Santa! Cruz)! dilués! au! 1/30e,! et! incubées! 1!h! à!
25!°C.!Les!cellules!sont!ensuite!lavées!au!PBS!et!centrifugées,!afin!d’éliminer!tous!les!anticorps! primaires! non! fixés.! Elles! subissent! ensuite! un! marquage! par! des! anticorps! secondaires! spécifiques! des! anticorps! de! souris,! conjugués! avec! de! la! phycoérythrine! (PE)! et! dilués! au! 1/100e! dans! du! PBS,! et! sont! incubées! 45!min! à! 4!°C! à! l’abri! de! la! lumière.! Cette! seconde!
incubation!est!réalisée!à!4!°C!afin!de!ralentir!les!mouvements!dans!les!membranes!cellulaires,!et! éviter! ainsi! l’internalisation! des! complexes! CD81"anticorps! formés.! Les! cellules! sont! ensuite! lavées!au!PBS,!centrifugées,!puis!resuspendues!dans!du!PBS!2!%!PFA!afin!de!fixer!le!marquage.! Les!marquages!doivent!être!réalisés!de!manière!à!obtenir!:!!
! Les! cellules! transfectées! avec! les! CPnp! et! marquées! avec! l’anticorps! CD81! et! l’anticorps! secondaire.!
! Les! cellules! non! transfectées! et! marquées! avec! l’anticorps! CD81! et! l’anticorps! secondaire!;! cette! population! constitue! un! contrôle! positif,! permettant! d’évaluer! le! niveau! d’expression! normal!de!CD81.!
! Les!cellules!transfectées!avec!les!CPnp!et!l’anticorps!secondaire!(permettant!de!vérifier!que! ce! dernier! ne! peut! se! lier! seul! aux! cellules! de! manière! non! spécifique)!;! c’est! un! contrôle! négatif.!
! Les!cellules!non!transfectées!(CD81)!et!l’anticorps!secondaire!(permettant!de!vérifier!que!ce! dernier!ne!peut!se!lier!seul!aux!cellules!de!manière!non!spécifique)!;!c’est!un!contrôle!négatif.! Les! cellules! sont! ensuite! passées! au! cytomètre! MACSQuant! Analyser! (Miltenyi).! Ce! dernier!est!d’abord!calibré!à!l’aide!des!populations!de!contrôles!négatifs,!afin!de!positionner!le! «!0!»,!c’est"à"dire!le!niveau!de!fluorescence!considéré!comme!non!spécifique,!donc!l’absence!de! CD81.! Il! est! important! de! régler! ce! niveau! car! les! cellules! possèdent! un! certain! niveau! d’autofluorescence,!qui,!s’il!n’est!pas!pris!en!compte!de!cette!manière,!pourrait!indiquer!à!tort!la! présence! de! fluorescence! spécifique,! ici! de! CD81.! La! population! de! cellules! non! transfectées!
"!96!"!
marquées,!le!contrôle!positif,!est!ensuite!analysé.!Cette!population!permet!de!mettre!en!place,! dans! notre! cas,! la! valeur! pour! laquelle! l’expression! de! CD81! est! considérée! comme! étant! de! 100!%,! une! fois! le! seuil! «!0!»! (du! marquage! non! spécifique)! soustrait.! Enfin,! les! cellules! transfectées! et! marquées! sont! analysées,! et! le! niveau! de! fluorescence! de! celles"ci,! après! soustraction! du! seuil! «!0!»,! est! rapporté! à! la! valeur! des! cellules! non! transfectées! afin! de! déterminer!le!pourcentage!d’expression!de!CD81!dans!cette!population.!!