Toutes! les! tumeurs! ne! sont! pas! accessibles! par! une! injection! intra"tumorale.! En! effet,! outre! les! tumeurs! sous"cutanées,! les! tumeurs! nécessitent! toutes! d’autres! modes! d’acheminement! des! traitements.! Si! les! possibilités! sont! variées,! elles! ne! sont! cependant! pas! toutes!envisageables!:!!
! Injection! intra"tumorale! en! chirurgie339!:! augmente! les! risques! liés! au! traitement,!
notamment! suite! à! la! nécessité! de! réaliser! l’injection! sous! anesthésie,! et! aux! risques! d’infections! associés! à! l’opération,! lorsque! la! tumeur! n’est! pas! sous"cutanée.! De! plus,! tout! protocole!itératif!d’injections!à!court!terme!est!exclu.!
! Implantation! d’une! «!pompe!»! sur! le! site! tumoral,! afin! de! libérer! le! traitement! progressivement340!:! comme! précédemment,! de! nombreux! risques! sont! associés! à! la!
chirurgie.! De! plus,! toutes! les! molécules! thérapeutiques! ne! peuvent! pas! se! conserver! correctement!dans!de!telles!conditions.!
! Injections! intra"péritonéales! ou! intraveineuses341!:! les! plus! couramment! utilisées,! mais!
nécessitant!la!certitude!que!les!molécules!thérapeutiques!atteignent!bien!leur!cible.!!
La! biodistribution! des! nanoparticules! de! type! CPnp(PEIPyr/siRNA)2,5,! après! injection!
intraveineuse,! a! été! évaluée! par! imagerie! de! fluorescence! à! l’aide! de! l’imageur! IVIS®! (Perkin!
Elmer)!dans!un!modèle!murin!de!cancer!orthotopique.!Le!modèle!utilisé!se!base!sur!la!méthode! utilisée! pour! obtenir! des! souris! présentant! des! foies! humanisés269.! Elle! consiste! en! l’injection!
splénique! dans! des! souris! Nude! de! cellules! Huh7Luc,! qui! vont! migrer! vers! le! foie!par! la! veine! splénique!et!la!veine!porte!hépatique!et!permettre!l’établissement!d’un!processus!tumoral.!Les! expériences! sont! réalisées! lorsque! deux! mesures! successives! des! tumeurs! détectées! par! bioluminescence!présentent!une!augmentation!du!signal,!et!atteignent!des!valeurs!supérieures!à! 105! RLU,! correspondant! à! des! tumeurs! de! plusieurs! millimètres.! Les! CPnp! ICG! (en! équivalent!
siRNA)!ont!été!injectées!à!raison!de!1!mg.kg"1.!Cette!dose!correspond,!en!moyenne,!à!la!quantité!
de! siRNA! couramment! injectée! in#vivo,! et! ayant! montré! une! certaine! efficacité! dans! plusieurs! modèles342–344.!
! Figure) IIIY14):) Observation) de) la) répartition) des) CPnp) marquées) par) incorporation) d’ICG) dans) le) cœur) de) phosphate)de)calcium,)injectés)par)voie)rétroYorbitale)dans)des)souris)Nude)présentant)une)tumeur)hépatique) Huh7Luc)(quantité)de)CPnp)injectée)correspondant)à)27)µg)de)siRNA).)Les)images)de)pseudoYfluorescence)ont) été)réalisées)2)minutes)(A.),)10)minutes)(B.),)2)h)(C.))et)24)h)(D.))après)l’injection)des)CPnp.) Comme!le!montrent!les!images!(Figure!III"14),!les!CPnp!sont!visibles!à!2!et!10!minutes! dans!le!foie!des!souris.!Après!2!h,!les!CPnp!sont!discernables!à!différents!niveaux!des!intestins! des!souris,!suggérant!un!passage!hépatobiliaire!ou!hépato"gastrique!(Figure!III"14C).!Au!bout!de! A.! B.! D.! C.!
"!141!"!
24!h,! la! grande! majorité! des! CPnp! semble! déjà! avoir! été! évacuée! (seules! deux! souris! sont! présentées!à!24!h!car!la!troisième!est!décédée!la!veille!suite!à!l’anesthésie).!!
En!parallèle,!des!mesures!de!bioluminescence!ont!permis!le!positionnement!des!tumeurs! (Figure!III"15).!Les!mesures!de!bioluminescence!ont!été!réalisées!après!celles!de!fluorescence,! afin!d’éviter!une!superposition!des!images.!En!effet,!la!bioluminescence!entraînant!une!émission! à! toutes! les! longueurs! d’ondes! du! spectre! visible,! sa! mesure! avant! la! fluorescence! pourrait! entraîner!la!présence!d’un!bruit!de!fond!artéfactuel!au!niveau!de!la!tumeur.!!
!
!Figure) IIIY15):) Mesure) de) bioluminescence) permettant) la) localisation) des) tumeurs) Huh7Luc) chez) les) souris) Nude)injectées)avec)les)CPnp)ICG)(quantité)équivalente)à)27)µg)de)siRNA).)A.)Image)de)bioluminescence)des) tumeurs) Huh7Luc) prise) à) 2)min) après) injection) des) CPnp.) B.) Superposition) de) l’image) de) fluorescence) des) CPnp)à)2)min)et)des)zones)tumorales)détectées)par)bioluminescence)(trait)pointillé)blanc).)
Les!images!de!bioluminescence!et!de!fluorescence!ainsi!comparées!mettent!en!doute!la! colocalisation!des!CPnp!et!des!tumeurs,!et!écartent!a!priori!l’idée!d’effet!EPR!des!tumeurs!sur!les! CPnp.!Ces!données!sont!cependant!à!confirmer,!car!les!tumeurs!obtenues!n’ont!pas!été!analysées! en!terme!de!vascularisation!et!de!flux!sanguin.!En!effet,!pour!pouvoir!observer!un!effet!EPR,!la! vascularisation! des! tumeurs! est! indispensable.! Il! pourrait! également! être! intéressant! de! renouveler!l’expérience!en!présence!d’un!facteur!améliorant!l’effet!EPR!comme!la!nitroglycérine! ou! l’angiotensine! II103.! Dans! les! tissus! sains,! en! présence! de! ces! facteurs,! la! pression! sanguine!
augmente,!et!les!muscles!lisses!entourant!les!vaisseaux!se!contractent,!renforçant!les!jonctions! cellule"cellule,! et! diminuant! les! risques! de! fuites.! Dans! les! tissus! tumoraux,! au! contraire,! les! vaisseaux!sanguins,!de!moins!bonne!qualité,!et!étant!moins!étanches,!vont!se!dilater!davantage! de! manière! passive,! et! favoriser! les! fuites,! et! donc! l’échappement! des! nanoparticules! dans! les! tissus!tumoraux103.!!
L’obtention! d’un! effet! EPR! pourrait! être! très! favorable! à! l’impact! des! CPnp! sur! la! croissance! tumorale.! Comme! indiqué! ci"dessus,! celui"ci! pourrait! favoriser! la! pénétration! des!
particules! dans! les! tissus! tumoraux,! mais! également! améliorer! leur! temps! de! contact! avec! les! cellules! tumorales.! En! effet,! il! a! été! démontré! que! la! rétention! de! macromolécules! ou! de! particules!au!niveau!tumoral!peut!être!prolongée!de!manière!importante!grâce!à!l’effet!EPR103.!!
L’ajout!d’une!couche!supplémentaire!sur!les!CPnp!pourrait!favoriser!le!contact!de!celles" ci! avec! les! cellules! tumorales,! et! améliorer! l’effet! EPR.! En! effet,! la! présence! d’une! charge! de! surface!neutre,!voire!légèrement!négative,!et!de!molécules!biocompatibles!en!surface!des!CPnp,! favorise!grandement!la!mise!en!place!d’un!effet!EPR,!sans!nécessité!d’ajouter!de!molécules!de! ciblage103.! Ces! modifications! pourraient! faciliter,! voire! prolonger! la! mise! en! contact! des! CPnp!
avec! les! cellules! tumorales,! et! ainsi! augmenter! les! possibilités! d’entrée! des! CPnp,! et! donc! l’efficacité!des!siRNA,!et!ce,!sans!restreindre!le!ciblage!à!un!type!cellulaire!et!tumoral!unique.!! !
"!143!"!
Conclusions!
Les!travaux!réalisés!au!cours!de!mes!trois!ans!de!thèse!ont!permis!de!caractériser!et!de! réaliser! la! preuve! de! concept! d’un! type! de! vectorisation! de! siRNA! prometteur! basé! sur! l’enrobage! multicouche! de! nanoparticules! de! phosphate! de! calcium.! Deux! formulations! de! nanoparticules!ont!été!analysées,!à!la!fois!in#vitro!et!in#vivo,!laissant!présager!de!leur!potentiel! thérapeutique.!!
La!première!formulation,!CPnp(siRNA/PEIY)2,!nanoparticules!d’environ!60!nm,!et!d’une!
stabilité!de!plus!de!6!jours,!a!montré!in#vitro!des!capacités!d’inhibition!de!l’expression!génique! jusqu’à! 95!%! à! trois! jours.! Par! ailleurs,! le! greffage! de! galactose! au! polycation,! permettant! de! cibler!le!récepteur!aux!asialo"glycoprotéines,!ne!modifie!pas!l’efficacité!fonctionnelle!du!vecteur.! Les! expériences! réalisées! in# vivo! ont! démontré! que,! si! une! dose! de! CPnp! enrobées! n’est! pas! suffisante! pour! inhiber! l’expression! d’un! gène! rapporteur,! gène! de! luciférase,! exprimé! par! les! cellules! tumorales,! un! effet! est! visible! grâce! à! l’injection! itérative! de! CPnp.! Cependant,! probablement! dû! en! partie! au! fait! que! l’inhibition! de! l’expression! de! ce! gène,! contrairement! à! d’autres! cibles,! n’a! a# priori! aucun! impact! sur! la! croissance! ou! même! la! physiologie! cellulaire,! l’inhibition!de!l’expression!de!cette!molécule!dans!une!tumeur!toujours!croissante!s’est!avérée! limitée!à!malgré!l’injection!itérative!de!CPnp.!!
La! comparaison! de! l’inhibition! de! l’expression! tumorale! de! la! luciférase! in# vivo! en! présence! de! CPnp! enrobées! avec! des! siRNA! ciblant! la! luciférase! ou! non"ciblants! a! également! permis! de! détecter! un! effet! off"target! des! nanoparticules,! probablement! dû! à! l’injection! trop! massive!d’un!siRNA!unique17.!Pour!remédier!à!cela,!l’emploi!de!siRNA!différents,!mais!ciblant!le!
même!gène,!ou!même!des!gènes!différents,!permettant!de!diminuer!la!quantité!individuelle!de! chaque!siRNA,!pourrait!être!une!solution.!!
Les! expériences! in# vivo! de! biodistribution! nous! ont! également! permis! de! confirmer! l’hypothèse!de!la!distribution!principale!des!particules!dans!le!foie!et!les!poumons,!que!les!CPnp! présentent! des! molécules! de! galactose! pour! le! ciblage! ou! non.! Il! semble! cependant! que! les! nanoparticules! ciblées! pénètrent! dans! les! cellules! par! deux! voies!:! l’endocytose! classique,! et! l’endocytose!médiée!par!récepteur,!principalement!associée!aux!cellules!phagocytes!de!Kupffer.! Bien!qu’il!ne!soit!pas!opérant!pour!cibler!les!cellules!tumorales!hépatiques,!ce!modèle!de!ciblage! de!récepteur!montre!l’intérêt!du!principe!pour!moduler!l’endocytose!des!CPnp.!Pour!des!raisons! notamment! de! cytotoxicité! du! PEI,! nos! recherches! se! sont! orientées! vers! une! nouvelle! formulation,! CPnp(PEIPyr/siRNA)2.5.! Comme! les! précédentes,! ces! nanoparticules! sont!
jours,!ainsi!que!dans!le!sérum.!De!plus,!nous!avons!observé!l’entrée!de!ces!nanoparticules!par! endocytose,!ainsi!que!la!colocalisation!du!cœur!de!phosphate!de!calcium!avec!les!siRNA!jusqu’à! une! semaine,! suggérant! la! possibilité! d’une! libération! ultérieure! de! siRNA.! Ces! résultats! ont! d’ailleurs!été!confirmés!par!qRT"PCR,!montrant!la!présence!de!siRNA!libres!pendant!au!moins!7! jours!dans!les!cellules.!!
Suite!à!la!caractérisation!de!cette!formulation,!nous!avons!réalisé!la!preuve!de!concept! d’efficacité!de!celle"ci!sur!un!premier!modèle!de!pathologie!:!l’infection!virale!par!le!HCV.!Que!les! CPnp! soient! utilisées! en! amont! de! l’infection,! ou! que! celle"ci! soit! déjà! chronique,! nous! avons! obtenu! une! inhibition! de! plus! de! 99,95!%! et! 96,9!%! de! l’infection,! respectivement,! en! ciblant! l’IRES!du!virus!à!l’aide!d’une!dose!non!toxique.!Dans!les!deux!cas,!ces!résultats!sont!supérieurs!à! ceux! obtenus! avec! les! techniques! commerciales! de! transfection,! ou! avec! l’utilisation! de! complexes! PEIPyr/siRNA! non! particulaires.! L’effet! obtenu! est! cependant! plus! faible! lorsque! l’infection!est!déjà!installée.!Ce!résultat!peut!s’expliquer!par!le!rapport!CPnp/cellules,!différent! dans!les!deux!conditions!du!fait!de!la!prolifération!cellulaire!qui!se!développe!durant!la!mise!en! place! de! l’infection! virale! dans! le! cas! de! post"infection.! Il! serait! des! plus! intéressants! de! renouveler!cette!expérience!sur!des!cellules!qui!ne!se!divisent!pas,!afin!de!pouvoir!contrôler!le! nombre!de!cellules!présentes!à!tout!moment,!comme!par!exemple!en!utilisant!des!hépatocytes! primaires!humains!(PHH).!Si,!de!manière!générale,!le!modèle!de!post"infection!est!plus!proche! de! la! réalité! de! l’infection! virale,! le! modèle! de! pré"infection! pourrait! cependant! présenter! un! intérêt! dans! le! cadre! des! transplantations! hépatiques! suite! au! HCV.! En! effet,! dans! ce! cas,! une! réinfection! quasi"immédiate! du! greffon! est! observée.! La! mise! en! place! d’un! traitement! par! les! CPnp!au!moment!de!la!transplantation!pourrait!éventuellement!empêcher,!ou!au!moins!ralentir! l’infection!du!nouveau!foie.!
Malgré!la!qualité!de!l’inhibition!obtenue!par!le!ciblage!du!virus,!celle"ci!n’est!pas!totale.! Cela!est!cependant!indispensable!pour!espérer!éradiquer!une!infection!virale!telle!que!le!HCV.! De! plus,! le! HCV! est! connu! pour! sa! grande! variabilité,! en! faisant! une! cible! complexe.! Son! cycle! viral! est! cependant! dépendant! d’un! certain! nombre! de! facteurs! hôtes! qu’il! peut! alors! être! intéressant! de! cibler,! ceux"ci! étant! bien! moins! soumis! à! mutations.! Nous! avons! montré! que! le! ciblage!de!facteurs!hôtes!nécessaires!à!l’entrée!du!virus!pouvait!être!une!approche!alternative!et! complémentaire.!Ainsi,!le!ciblage!de!CD81!permet!d’inhiber!de!façon!importante!l’expression!de! ce! facteur! d’entrée,! tandis! que! le! ciblage! de! CLDN1! lors! de! l’infection! virale! permet! d’inhiber! l’infection!virale!jusqu’à!96,3!%!dans!le!modèle!de!pré"infection,!et!seulement!de!50!%!en!post" infection,!ce!qui!peut,!dans!ce!dernier!cas,!s’expliquer!par!la!persistance!de!l’infection!dans!les! cellules! en! culture.! En! effet,! CLDN1,! contrairement! à! d’autres! facteurs! hôtes! comme! ApoE,! ne! participe!pas!au!cycle!viral!en!lui"même,!mais!bien!à!son!entrée!dans!les!cellules.!Le!ciblage!de!ce!
"!145!"! facteur!est!inopérant!sur!le!virus!internalisé,!mais!cependant!empêche!l’infection!de!nouvelles! cellules!encore!saines.!! Afin!de!pouvoir!améliorer!les!résultats!obtenus,!il!serait!intéressant!de!ne!pas!seulement! cibler!le!virus!ou!un!facteur!de!l’hôte,!mais!d’employer!des!combinaisons!renouvelées!de!siRNA! utilisés!de!manière!synergique.!Il!pourrait!alors!être!possible!d’éviter!l’échappement!viral!et!de! juguler!l’infection.!Se!pose!alors!la!question!de!savoir!quel!serait!le!mode!de!vectorisation!le!plus! intéressant!:!multiplier!les!populations!de!CPnp,!enrobées!chacune!avec!un!type!de!siRNA!précis,! ou!combiner!les!siRNA!avant!d’enrober!les!CPnp.!!
Ayant! prouvé! l’intérêt! potentiel! des! CPnp! dans! le! traitement! de! pathologies! virales! comme!l’hépatite!C,!nous!nous!sommes!également!intéressés!à!réaliser!une!preuve!de!concept! de! l’efficacité! des! CPnp! dans! le! cadre! de! pathologies! tumorales! et! cancéreuses.! Pour! cela,! un! modèle!de!culture!3D!mimant!en!partie!les!conditions!in#vivo#a!été!utilisé!pour!l’étude!des!CPnp!
in# vitro#:#les! sphéroïdes.! Ces! amas! cellulaires! sphériques! présentent! en! effet! des! interactions!
cellule"cellule! s’approchant! plus! des! conditions! tissulaires! que! les! cultures! cellulaires! bidimensionnelles.!Ce!modèle!nous!a!permis!de!mettre!en!évidence!quatre!cibles!intéressantes! pour!le!traitement!de!tumeurs!de!type!hépatique!en!particulier!:!CTNNB1,!EGFR,!KRAS,!et!E2F1.! En!effet,!le!ciblage!de!ces!éléments!importants!de!différentes!voies!de!signalisation!permet!un! ralentissement!significatif!de!la!croissance!des!sphéroïdes.!Il!semble!cependant!que!les!CPnp!ne! puissent! pas! pénétrer! au! cœur! même! des! sphéroïdes,! expliquant! partiellement! l’impact! limité! des! CPnp! sur! la! croissance! de! ceux"ci.! L’évolution! du! modèle,! ou! le! choix! d’un! type! cellulaire! différent,!ou!même!le!travail!sur!une!tumeur!issue!d’une!biopsie!pourrait!permettre!de!remédier! à!ce!problème,!ou!éventuellement!de!prouver!que!celui"ci!est!spécifique!des!cellules!utilisées!ici,! les!Huh7.!Dans!le!cadre!de!l’étude!des!sphéroïdes,!mais!également!lors!du!traitement!de!tumeurs! sous"cutanées,!l’éventualité!de!pouvoir!injecter!les!CPnp!directement!au!cœur!de!la!tumeur!et! non!pas!de!les!diluer!au!milieu!périphérique!pourrait!également!être!intéressante.!
L’évaluation! in# vivo! par! injection! intra"tumorale! d’une! dose! de! nanoparticules! correspondant!à!10!µg!de!siRNA!dans!un!modèle!de!tumeur!sous"cutanée!Huh7Luc!a!permis!de! valider!la!fonctionnalisation!des!CPnp!avec!l’ICG,!agent!d’imagerie.!Cette!approche!a!par!ailleurs! confirmé!que!l’injection!en!dose!unique,!quelle!qu’elle!soit,!est!insuffisante!à!inhiber!l’expression! de!la!luciférase!dans!les!cellules!tumorales!prolifératives!utilisées.!Les!futures!évaluations!in#vivo! cibleront,! de! façon! plus! pertinente,! l’inhibition! de! la! croissance! tumorale! avec! des! CPnp! enrobées! de! siRNA! dirigés! contre! des! oncogènes! tels! ceux! mis! en! évidence! dans! le! modèle! de! prolifération! cellulaire! 3D.! La! biodistribution! des! CPnp! dans! un! modèle! murin! de! tumeur! hépatique!suite!à!l’injection!i.v.!rétro"orbitale!de!CPnp!ICG!montre!une!localisation!initiale!des! CPnp! dans! le! foie.! Cependant,! en! quelques! heures,! elles! passent! dans! les! intestins! par! la! voie!
hépatobiliaire,!et!sont!éliminées!en!moins!de!24!h.!De!plus,!aucune!colocalisation!entre!les!CPnp! et!la!tumeur!n’a!été!objectivée.!Le!développement!de!molécules!de!ciblage!pertinentes!devrait! permettre! d’orienter! la! biodistribution! des! nanoparticules,! mais! également! de! ralentir! leur! élimination.! Pour! cela,! il! pourrait! être! opportun! de! prendre! exemple! sur! les! ciblages! existant! naturellement.!Ainsi,!nous!avons!vu!auparavant!la!façon!dont!le!HCV!approche!les!hépatocytes! avant!même!d’interagir!avec!les!facteurs!d’entrée.!De!la!même!manière,!le!ralentissement!et!la! sortie! des! cellules! immunitaires! du! flux! circulant! vers! les! tissus! (rolling! et! diapédèse)! est! un! mécanisme! qu’il! pourrait! être! intéressant! d’imiter.! Celui"ci! nécessite! cependant! l’interaction! avec!différents!récepteurs,!et!il!sera!important!de!s’assurer!que!le!ciblage!ajouté!en!surface!des! nanoparticules!ne!change!pas!leurs!propriétés.!! Il!sera!également!intéressant!d’étudier!in#vivo!l’impact!d’une!troisième!couche!de!siRNA! sur!les!CPnp!(CPnp(PEIPyr/siRNA)3).!En!effet,!celles"ci!sont!plus!toxiques!in#vitro,!probablement! du!fait!de!l’effet!off"target!des!siRNA,!mais!en!variant!les!siRNA,!ces!nanoparticules!pourraient! permettre!de!prolonger!d’autant!la!durée!d’action!du!traitement.!Il!est!cependant!indispensable! auparavant! d’améliorer! la! biodistribution,! afin! de! «!laisser! une! chance!»! aux! CPnp! d’atteindre! leur!site"cible!et!d’entrer!dans!les!cellules.!!
Il! sera! également! important! à! court! terme,! d’étudier! l’impact! des! CPnp! sur! le! système! immunitaire!in#vivo.!En!effet,!comme!mentionné!dans!l’introduction,!les!siRNA!peuvent!activer!le! système! immunitaire,! principalement! inné.! Il! conviendra! d’examiner! la! possibilité! d’activation! du! système! immunitaire! contre! les! CPnp! et! l’effet! délétère/bénéfique! de! celle"ci! sur! le! traitement.!En!particulier,!la!production!d’interférons!lors!de!la!reconnaissance!des!siRNA!par!le! système!des!TLR!est!des!plus!intéressantes,!notamment!dans!le!cadre!des!cancers.!En!effet,!les! interférons!de!type!I!ont!pour!effet!d’activer!la!réponse!immunitaire!adaptative,!et!pourraient! ainsi!associer!l’effet!direct!des!CPnp!au!déclenchement!d’une!«!pseudo"immunothérapie!».!Pour! étudier! cela,! il! sera! important! de! travailler! dans! des! lignées! murines! immunocompétentes,! contrairement!à!celles!utilisées!ici.!
Pour!conclure,!les!CPnp!sont!des!vecteurs!particulièrement!intéressants!et!prometteurs,! notamment!par!leur!grande!versatilité.!La!possibilité!d’y!ajouter!des!molécules!de!ciblage,!ainsi! que! des! agents! d’imagerie,! permettant! leur! suivi! in#vitro! et! in#vivo,! fait! de! ce! vecteur! un! outil! théranostique,!ouvrant!la!voie!à!de!multiples!applications!de!ces!nanoparticules.!!
! ! !
"!147!"!
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