1.4.6.1 Introdução à espectroscopia de FT-IR
A região do infravermelho do espectro electromagnético (10-14000 cm-1) é dividida em 3 regiões: Infravermelho próximo (NIR), médio (MIR) e longínquo (FIR). O infravermelho médio (400-4000 cm-1) é a região mais usada para a análise da estrutura molecular. Nesta região encontram-se as frequências de absorvância características das vibrações moleculares fundamentais nesta gama (Davis, 2010), conforme a tabela 40 do anexo D.
A espectroscopia de infravermelho é um tipo de espectroscopia de absorção que utiliza radiações na gama de radiações denominada de infravermelho do espectro eletromagnético. Esta técnica espetroscópica baseia-se no facto de as ligações químicas das substâncias possuírem frequências de vibração específicas, às quais correspondem níveis de energia da molécula (níveis vibracionais). Tais frequências dependem da forma da superfície de energia potencial da molécula, da geometria molecular, das massas dos átomos e eventualmente do acoplamento de vibração (Pavia, 1996) (Smith, 1996)
No processo de absorção, as frequências de radiação de infravermelho que se igualam com as frequências vibracionais naturais da molécula (origem da maneira de extensão – simétrica e assimétrica, de flexão e outros) em questão são absorvidas, e a energia absorvida serve para aumentar a amplitude dos movimentos vibracionais das ligações na molécula (Pavia, 1996). Mas nem todas as ligações numa molécula absorvem a energia de infravermelho, mesmo se a frequência da radiação se igualar à frequência do movimento da ligação. Apenas as ligações que têm alterações no momento dipolar em função do tempo são capazes de absorver radiação de infravermelho. As ligações simétricas, como as que acontecem por exemplo no H2 ou no Cl2, não absorvem radiação
de infravermelho. Para que a energia possa ser transferida, uma ligação deve apresentar um dipolo elétrico que se altera à mesma frequência que a nova radiação. Como exemplo, uma molécula de água que apresenta três modos vibracionais ativos em infravermelho (extensão simétrica, assimétrica e flexão) e a molécula de dióxido de carbono, com apenas dois modos vibracionais ativos em infravermelho (extensão assimétrica e flexão).
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Considerando o exemplo da molécula de água figura 9, vê-se que os átomos de oxigénio e de hidrogénio não estão em linha reta e fazem um ângulo de 105º. Os 10 eletrões da molécula permanecem mais próximos do núcleo de oxigénio do que do núcleo de hidrogénio, fazendo com que a zona ao redor do oxigénio seja mais negativa do que a zona ao redor do hidrogénio criando assim um dipolo. O momento dipolo altera-se na direção do movimento dos átomos de oxigénio como apresentado pelas setas na figura 9.
(a) Extensão simétrica (b) Flexão simétrica (c) Extensão assimétrica
Figura 9: As três vibrações fundamentais da molécula de água. O movimento do átomo de oxigénio, que deve ocorrer para manter estacionário o centro da gravidade da molécula, é aqui ignorado (Banwell, 1983)
Atualmente, o sistema mais comum de registo de um espectrofotómetro de transformadas de Fourier é composto por três componentes básicos: a fonte de radiação, o interferómetro e o detetor (Settle, 1997). Na figura 10, está representado um esquema simples do interferómetro mais utilizado em FTIR: o interferómetro de Michelson.
Figura 10: Esquema de um interferómetro de Michelson, adaptação de (Settle, 1997).
O interferómetro de Michelson consiste em três principais componentes: espelho móvel, espelho fixo e divisor de feixe. Os dois espelhos estão perpendiculares um ao outro. O divisor de feixe é um componente semi-refletor. A radiação da fonte de infravermelho é corrigida e direcionada para o interferómetro, mais especificamente para o divisor de feixe. Metade dessa radiação é transmitida para o espelho fixo, e a restante é refletida para o espelho móvel. Depois dos dois feixes serem refletidos nos espelhos, são recombinados no divisor de feixe. Devido a alterações na posição relativa do espelho móvel em relação ao
Espelho
Detetor
Fonte Espelho
Divisor do feixe
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espelho fixo, é gerada uma interferência. A radiação resultante passa então através da amostra e vai para o detetor. São obtidos assim vários interferogramas (conduzindo a diminuição no ruído), obtendo-se no final um interferograma médio (Settle, 1997). São então aplicadas as Transformadas de Fourier (tratamento matemático que utiliza uma transformada integral expressando uma função em termos de funções de base sinusoidal), obtendo-se um espectro de transmitância em função de frequência. Este pode ser convertido num espectro de absorvância em função da frequência ou número de onda. O espectro de FTIR em absorvância respeita a lei de Beer, que relaciona a concentração com a absorvância,
A = l ε c;
onde A= absorvância; l= comprimento do feixe; ε – absortividade; c – concentração.
Um espectro de infravermelho é medido pelo cálculo da intensidade antes e depois de passar pela amostra. Para análise quantitativa é necessário que o espetro esteja nas unidades de absorvância (Smith, 1999).
1.4.6.2 ATR – Célula de reflexão total atenuada
Para este estudo, o MIR foi realizado usando uma célula de reflexão total atenuada – “attenuated total reflection” – ATR. Esta técnica baseia-se na aplicação da amostra numa superfície de material com índice de refração elevado (cristal de diamante no caso do Golden Gate), conhecido como elemento de reflexão interno (IRE). Quando a radiação de infravermelho penetra no IRE, a um ângulo abaixo do ângulo de incidência crítico, a reflexão total interna desta radiação incidente produz uma onda que se dissipa no limite entre o IRE e a amostra (Sing, 2000). A radiação refletida penetra através do cristal, podendo ser absorvida por amostras em contacto com a sua superfície tal como se pode observar na figura 11 (Smith, 1996). A profundidade da penetração depende do material, do IRE e do comprimento de onda a que absorve.
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Figura 11: Diagrama esquemático do mecanismo da técnica de reflexão total atenuada adaptado de (Smith, 1996)
Esta técnica permite uma análise rápida e não destrutiva da amostra, uma vez que não requer uma preparação prévia da amostra. Os espectros de FTIR, de amostras intactas, opacas e/ou de origem biológica, podem ser obtidos por ATR e assim não é necessário o uso de qualquer tipo de células de suporte especiais. Estes fatores resultam numa análise muito simples de executar.
1.4.6.3 Analise Estatística –PCA
O PCA é usado para reduzir a multidimensionalidade dos dados nos seus componentes ou scores dominantes mantendo a variação relevante entre os resultados. O PCA identifica os clusters (grupos), nos dados principais com a PC a expressar a maior variação, seguida pela segunda componente e assim sucessivamente (Davis, 2010), agrupando as amostras por características semelhantes.