Recherche de la β –galactosidase :

C'est une recherche complémentaire à l'étude de la dégradation du lactose; elle est encore appelée test ONPG (orthonitrophényl- β-D- galactopiranoside) [88].

Principe :

Le test ONPG permet de détecter l'enzyme capable de scinder la molécule du lactose en glucose et galactose.

Son principe repose sur le fait que l'ONPG, analogue structural du lactose, incolore s'hydrolyse par l'ONPG hydrolase, en galactose, et en orthonitrophénol, composé soluble jaune [88,128].

Technique :

Préparer une suspension bactérienne laiteuse dans 0,5 ml d'eau physiologique stérile. Plus la suspension sera dense, plus rapide sera la réaction

Ajouter un disque d'ONPG, et incuber à 37°C jusqu'à 24 heures au maximum. La réaction peut se montrer positive pour des temps d'incubation variant entre quelques minutes et 24 heures [88].

 Une coloration jaune citrine indique un test ONPG (+).

 Une absence de coloration signifie un test ONPG (-) [88].

11. Recherche des enzymes respiratoires :

11.1. Recherche de la catalase :

La catalase est une enzyme qui catalyse la décomposition du peroxyde d'hydrogène (H2O2) en eau et en oxygène, selon la réaction suivante:

La catalase est synthétisée par la plupart des bactéries aérobies, elle élimine l'H2O2 produit au cours du métabolisme aérobie en empêchant son accumulation, vue sa létalité pour la cellule bactérienne [132].

Technique :

Sur une lame porte-objet, déposé une goutte d'H2O2 à 10 volumes; puis dissoudre une colonie de la bactérie, prélevée sur la culture en milieu gélosé [88].

Lecture :

La présence de la catalase se marque par un dégagement immédiat des bulles gazeuses [132].

11.2. Recherche de la nitrate réductase :

Principe :

Certaines bactéries peuvent utiliser les glucides en anaérobiose en présence d'un accepteur d'hydrogène qui peut être l'ion NO3. Ces bactéries possèdent une enzyme spéciale, la nitrate réductase, qui catalyse la réduction des nitrates (NO3-) en nitrites (NO2-), elle est recherchée selon la réaction de Griess : [80]

Technique :

Ensemencer un tube de bouillon nitraté (1‰ de KNO3) [M19] à partir de la suspension bactérienne. Incuber pendant 24 heures à 37°C [80].

Lecture :

Après avoir vérifié la présence de culture ajouter 4 gouttes de chacun des réactifs de Griess :

2H

O

2H

O + O

catalase

NO

+ H

NO

_{+ H}

2H

H

O

grenadine.

 L'apparition d'une telle coloration ou une coloration rose est signe de transformation de nitrates en nitrites. L'espèce est alors, nitrate réductase (+).

 L’absence de coloration ne signifie pas obligatoirement que l'espèce est NR (-). Elle peut

signifier deux cas :

a) les nitrates n'ont pas été réduits ;

b) les nitrites sont formés, mais ont été ensuite, réduits, en azote, c-à-d que la bactérie a dépassé le stade de nitrites

Pour distinguer entre ces deux possibilités, on procède à un test confirmatif, c'est la réaction de Zoo-Bell.

Il consiste à tester le milieu pour la présence de nitrates en ajoutant une pincée de poudre de zinc, réducteur de nitrates.

 s'il persiste de nitrates dans le milieu, le zinc va les réduire en nitrites, et la coloration apparaît,

l'espèce sera alors définitivement NR(-)

 si au contraire, les nitrites ont été dégradés, le milieu reste incolore, et l'espèce est dite alors NR(+) [132,133].

3.2.2. Recherche de Salmonella et de Shigella :

La méthode de recherche des ces deux bactéries, découle de deux données :

 d'une part leur présence en nombre relativement faible dans les eaux, ainsi que leur difficulté

d'y survivre.

 d'autre part, l'existence habituelle d'un nombre important de germes d'accompagnement d'origine fécale (coliformes, streptocoques) ou non (Pseudomonas, Achromobacter,…etc). Ces germes ont tendance à supplanter les germes pathogènes, qui disparaissent rapidement. Ces constatations entraînent l'obligation d'utiliser des milieux d'enrichissement sélectifs dans le but d'inhiber le développement des autres bactéries [04].

Milieux de culture :

a) milieu d'enrichissement :

Le bouillon au sélénite (S.F.B) ou milieu de Leifson [M20], ensemencé avec un produit polymicrobien renfermant des Salmonella, permet d'augmenter la proportion de ces derniers et d'inhiber la croissance des bactéries coliformes et des entérocoques dans les 12 heures suivant le début de l'incubation; ensuite, l'action inhibitrice diminue lentement. Salmonella et Proteus en revanche sont peu inhibés dès le début [134].

b) milieux d'isolement :

-La gélose Hektoen [M21] : la présence de l'extrait de levure, de sucres et de peptones dans ce milieu favorise la croissance de Salmonella et de Shigella ; des sels biliaires assurent le pouvoir

Le milieu Hektoen contient trois types de glucides: la saliciline, le saccharose et le lactose. L'orientation de l'identification des colonies isolées est fondée sur l'attaque de ces trois glucides, les Salmonelles et les Shigelles n'attaquant aucun de ces glucides.

Un autre caractère biochimique que l'on peut suivre sur ce milieu est la production d'H2S à partir de thiosulfate. Elle se traduit par l'obtention des colonies à centre noire, coloration due à la formation de sulfate de fer. Deux indicateurs sont présents dans le milieu: le bleu de bromothymol, et la fuschine acide qui se colore en présence d'aldéhyde, on observe alors une teinte saumonée si la souche utilise un ou plusieurs glucides présents [129].

-La gélose Salmonella-Shigella (S-S) [M22] : ce milieu contient trois inhibiteurs : sels biliaires, vert brillant et forte concentration en citrate de sodium. Ceux-ci empêchent la pousse de toutes bactéries Gram (+), et rendent difficile la croissance des bactéries Gram (-) autres que Salmonella et Shigella. Le milieu contient du lactose dont la fermentation est révélée par le virage de l'indicateur coloré, le rouge neutre, à sa teinte acide. Il contient aussi de thiosulfate à partir duquel les bactéries qui en sont capables de pousser peuvent produire H2S, qui sera révélé par le citrate ferrique. Si la bactérie produit l'H2S, en présence du fer III, un précipité noir se forme au centre de la colonie [129].

Mode opératoire :

La recherche de Salmonella et de Shigella comporte plusieurs étapes:

1- Enrichissement : introduire 1 ml de l'échantillon d'eau dans 10 ml de S.F.B. Incuber à 37°C