A análise estatística da estereologia a partir do princípio de Cavalieri mostra que não
há diferença significativa da média de volume em µm3 da substância branca, substância cinzenta, coluna posterior e volume total da medula espinal de saguis comparando o grupo adulto/jovem macho e o idoso macho. Em relação ao gênero observamos que o teste T para volume da coluna posterior não demostra diferença significativa. Assim como não foi encontrado diferença estatística significativa entre machos e fêmeas em relação a substância branca e substância cinzenta. Já o volume total da medula espinal demostrou uma diferença significativa das fêmeas em relação aos machos, apresentando valor de P de 0,045.
Tabela 6: teste T para duas amostras do Vref. total entre gêneros. Fonte: Fonte: adaptado de IBM SPSS Statistics. N MÉDIA (µm3) DP CV P M 6 590,8 116,5 0,19 0,045t F 7 746,1 250,4 0,33
M. macho, F. fêmea, DP. Desvio padrão, CV. Coeficiente de variação, P. Significância
Tabela 7: teste T para duas amostras do Vref. substância branca entre gêneros. Fonte: adaptado de IBM SPSS Statistics.
N MÉDIA (µm3) DP CV P
M 6 403,0 85,8 0,21
0,063t
F 7 500,0 180,1 0,36
M. macho, F. fêmea, DP. Desvio padrão, CV. Coeficiente de variação, P. Significância
Tabela 8: teste T para duas amostras do Vref. substância cinzenta entre gêneros. Fonte: adaptado de IBM SPSS Statistics. N MÉDIA (µm3) DP CV P M 6 187,8 38,7 0,20 0,092t F 7 245,49 74,1 0,30
M. macho, F. fêmea, DP. Desvio padrão, CV. Coeficiente de variação, P. Significância
Tabela 9: teste T para duas amostras do Vref. coluna posterior entre gêneros. Fonte: adaptado de IBM SPSS Statistics.
N MÉDIA (µm3) DP CV P
M 6 50,0 9,66 0,19
0,080t
F 7 61,7 15,3 0,24
M. macho, F. fêmea, DP. Desvio padrão, CV. Coeficiente de variação, P. Significância
Tabela 10: teste T para duas amostras do Vref. total entre grupos etários. Fonte: adaptado de IBM SPSS Statistics.
N MÉDIA (µm3) DP CV P
A/J 6 590,8 116,5 0,19
0,218 t
I 4 663,8 209,3 0,31
A/J. Adulto/jovem, I. Idoso, DP. Desvio padrão, CV. Coeficiente de variação, P. Significância
Tabela 11: teste T para duas amostras do Vref. substância branca entre grupos etários. Fonte: adaptado de IBM SPSS Statistics.
N MÉDIA (µm3) DP CV P
A/J 6 403,0 85,8 0,21
0,292 t
I 4 464,8 145,6 0,31
A/J. Adulto/jovem, I. Idoso, DP. Desvio padrão, CV. Coeficiente de variação, P. Significância
Tabela 12: teste T para duas amostras do Vref. substância cinzenta entre grupos etários. Fonte: adaptado de IBM SPSS Statistics. N MÉDIA (µm3) DP CV P A/J 6 187,8 38,7 0,20 0,107 t I 4 198,9 76,8 0,38
A/J. Adulto/jovem, I. Idoso, DP. Desvio padrão, CV. Coeficiente de variação, P. Significância
Tabela 13: teste T para duas amostras do Vref. coluna posterior entre grupos etários. Fonte: adaptado de IBM SPSS Statistics.
N MÉDIA (µm3) DP CV P
A/J 6 50,0 9,6 0,19
0,174 t
I 4 52,5 19,8 0,37
A/J. Adulto/jovem, I. Idoso, DP. Desvio padrão, CV. Coeficiente de variação, P. Significância
O volume total da medula espinal calculada pelo princípio de Cavalieri mostra que a proporção da substância cinzenta em relação a branca foi de 32,99% e 67,01% no adulto jovem macho enquanto a fêmea da mesma faixa etária apresentava uma proporção de 37,72% e 62,22%. O idoso macho apresenta uma a proporção de substância cinzenta e branca de 29,96% e 70,04%, respectivamente.
Figura 24: gráfico de comparação em µm³ da substância branca, cinzenta e coluna posterior dos grupos gênero e etário. Fonte: Elaborado pelo autor.
0 50 100 150 200 250 300
J/A macho IDOSO J/A fêmea
µm
3
6. DISCUSSÃO
6.1. Análise qualitativa entre gênero das lâminas de Rexed da coluna posterior da medula espinal
A delimitação dessas camadas e regiões é, portanto, baseada principalmente nas características citoarquitetônicas das células nervosas (REXED Bor, 1952). Na citoarquitetura feita através do método de Níssil aparentemente é observado uma semelhança entre as lâminas de todos os segmentos da medula espinal de saguis entre machos e fêmeas.
A lâmina I do segmento cervical apresentou aparentemente pequenos neurônios distribuídos em uma lâmina fina que apresenta curvatura seguindo até a lâmina III. A lâmina II apresenta ao que parece nas imagens, neurônios pequenos e arredondados. A lâmina III apresenta um aparente aumento no tamanho de alguns neurônios em meio a neurônios menores, enquanto a lâmina IV exibe neurônios grandes em toda a extensão da lâmina. A lâmina V apresenta neurônios grandes concentrados na sua área intermédia, enquanto a lâmina VI mostra grandes neurônios concentrados mais medialmente (Fig.12).
Ainda sobre comparação laminar entre gêneros, observamos que no segmento torácico, aparentemente a lâmina I tanto os machos como em fêmeas apresentam um aspecto delgado com neurônios pequenos e arredondados, além de exibir uma curvatura. A lâmina II apresenta pequenos neurônios em uma lâmina mais espessa que a anterior, enquanto a lâmina III exibe neurônios aparentemente um pouco maiores. Posteriormente, a lâmina IV possuem neurônios do mesmo tamanho que a lâmina III, porém com neurônios distribuídos mais uniformemente em toda a extensão. A lâmina V apresenta aparentemente neurônios grandes concentrados na porção lateral da lâmina. A última lâmina apresenta grandes neurônios distribuídos em toda a sua dimensão, (Fig.13).
No segmento lombar em ambos os gêneros é observável a lâmina I delgada com neurônios pequenos e arredondados distribuídos em toda sua extensão. A lâmina II apresenta um aparente aumento na sua espessura em relação a lâmina I, porém continua a apresentar neurônios pequenos e arredondados. A terceira lâmina, aparentemente apresenta neurônios maiores concentrados no centro da lâmina, em meio a neurônios pequenos. A lâmina IV nos dois gêneros, apresenta neurônios grandes em sua maioria, em meio a neurônios pequenos. A lâmina V aparentemente mostra uma concentração maior de grandes neurônios na região
intermédia da lâmina. A lâmina VI apresenta aparentemente neurônios grandes com uma concentração maior na região medial da lâmina (Fig.14).
A lâmina I do segmento sacral apresenta aparentemente neurônios pequenos e arredondados, distribuídos em toda a lâmina. A lâmina II é apresentada aparentemente com a mesma espessura que a I em níveis superiores, há um aumento em sua espessura na porção mais medial nos níveis inferiores, além dos neurônios dessa lâmina serem pequenos e arredondados. A lâmina III apresenta uma continuidade do tamanho e forma neuronal, enquanto a lâmina IV apresenta aparentemente grandes neurônios. Na lâmina V há uma continuidade em relação as características da lâmina anterior, porém com um aumento aparente na sua espessura, enquanto não há formação da lâmina VI no segmento (Fig.15).
6.2. Análise qualitativa entre faixa etária das lâminas de Rexed da coluna posterior da medula espinal
O método de níssil realizado nas medulas de animais idosos e adultos/jovens no segmento cervical, demostrou uma aparente semelhança na comparação entre todas as lâminas. A lâmina I apresenta uma espessura delgada além de uma distribuição de pequenos neurônios. A lâmina II apresenta uma aparente continuidade em sua espessura comparada a lâmina I, assim como na forma, distribuição e tamanho, nas duas faixas etárias. A lâmina III aparentemente apresenta neurônios do pequenos e arredondados, assim como as outras lâminas. Na lâmina IV as características de espessura, tamanho e dispersão de neurônios da lâmina III são mantidas nas faixas etárias. A lâmina V apresenta aparentemente a mesma espessura que a lâmina IV em idosos e adultos/jovens, porém com a presenta de neurônios maiores em meio a poucos neurônios pequenos. Aparentemente a lâmina VI Apresenta neurônios grandes, arredondados e piramidais em toda a sua extensão (Fig.16).
O segmento torácico nas duas faixas etárias possui a lâmina I estreita em comparação a lâmina II, neurônios pequenos e arredondados. A lâmina II aparentemente apresenta neurônios pequenos e arredondados, com uma espessura maior que a lâmina I. A terceira lâmina apresenta um aparente aumento em sua espessura em segmentos superiores da medula espinal e em segmentos inferiores apresenta a mesma espessura da lâmina anterior, seus neurônios são pequenos e arredondados. A lâmina IV aparentemente possui uma espessura similar a lâmina III, com neurônios do mesmo tamanho e formato que a lâmina anterior. A lâmina V apresenta neurônios pequenos em meio a maioria de neurônios grandes, com formatos arredondados e piramidais. Neurônios grandes, piramidais e
arredondados aparentemente são observados em toda a lâmina VI, que apresenta uma espessura similar a lâmina V em idosos e adultos/jovens (Fig.17).
O segmento lombar ao que parece apresenta em suas três primeiras lâminas neurônios pequenos e arredondados, além de lâminas proporcionais em espessura. Em níveis inferiores é observado a presença de alguns neurônios maiores. A lâmina IV se torna aparentemente mais larga em secções superiores e proporcional as lâminas anteriores em secções inferiores. Nesse segmento é visível a presença de grandes e pequenos neurônios distribuídos na lâmina IV. A lâmina V aparentemente apresenta uma espessura menor que a anterior com neurônios grandes em meio a neurônios menores. A lâmina VI apresenta aparentemente grandes neurônios em todos os gêneros (Fig.18).
A lâmina I e II do segmento sacral apresenta aparentemente neurônios pequenos e arredondados além de uma espessura similar. A lâmina III apresenta uma continuidade do tamanho e forma neuronal, enquanto a lâmina IV apresenta aparentemente um aumento no tamanho dos neurônios. Na lâmina V há uma continuidade em relação as características da lâmina anterior, porém com um aumento aparente em sua espessura. Não há presença na formação da lâmina VI no segmento sacral (Fig.19).
6.3. Morfometria
Os dados obtidos sugerem que há estabilidade em relação a área dos neurônios da substância cinzenta da coluna posterior entre faixas etárias analisando tanto lâmina por lâmina, quanto em toda sua integridade. Os dados apresentados são corroborados por Portiansky, E. L. et al. (2004), propondo através de seus resultados, que o envelhecimento moderado não afeta significativamente a estrutura da substância cinzenta da medula espinal de rato. Apesar dos nossos resultados não demostrarem diferença significativa sobre área dos neurônios entre essas faixas etárias há um aparente aumento na área neuronal da coluna posterior e separadamente nas lâminas I, II, III, IV e VI. Na literatura esse aumento da área é explicado devido a alterações bioquímicas como a diminuição da expressão de PTEN (homólogo de fosfatase e tensina no cromossomo 10) e a fosforilação de Akt (proteína quinase específica para serina / treonina) aumenta e que estas mudanças são acompanhadas por um aumento do número de neurônios (AHN et al., 2011), ou alterações no perfil bioquímico da lectina, que pode estar relacionado ao aumento da proporção da substância cinzenta na região cervical da medula espinal de ratos (LOZZA et al., 2009). No entanto,
essas alterações morfológicas e bioquímicas não representam necessariamente uma situação patológica e podem refletir uma reorganização plástica do tecido nervoso. (FONTANA et al., 2009).
Em relação a comparação entre gêneros, a análise estatística também não aponta alteração significativa na área dos neurônios tanto em relação a lâmina por lâmina, quanto em relação a toda a área da coluna posterior. Não foi encontrado na literatura quadros de dimorfismo sexual relacionado coluna posterior da substância cinzenta, sendo concentrados os estudos nos neurônios motores dos núcleos bulbo cavernosos situados na região torácica e lombar da coluna anterior. (FORGER e BREEDLOVE, 1986; MORRIS et al., 2004)
6.4. Imunoistoquímica
Diversos estudos têm demostrado que o sistema serotoninérgico participa ativamente da regulação do circuito nociceptivo e locomotorda medula espinal (BARBEAU e ROSSIGOL, 1990; CROWN e GRAU, 2005). O aumento da neurotransmissão serotoninérgica facilita o impulso motor e inibe o processamento da informação nociva aferente (JACOBS et al., 2002).
A serotonina (5-HT) é uma indolamina sintetizada a partir do aminoácido triptofano principalmente em neurônios localizados próximos a linha média do tronco encefálico, nos chamados núcleos da rafe. O núcleo da rafe bulbar e o núcleo magno da rafe, possuem projeções que finalizam na medula espinal (coluna posterior e coluna intermédio lateral) e se destinam ao controle do sistema nervoso simpático e da modulação nociceptiva (HAINS et al., 2002; JACOBS et al.,2002). Na medula espinal, as maiores concentrações de 5-HT ocorrem nas lâminas I e II, onde finalizam os aferentes primários nociceptivos (HAINS et al., 2002).
As colunas posteriores na literatura, são menos marcadas para serotonina do que as colunas anteriores, devido aos núcleos de neurônios motores (HADJICONSTANTINOU et al., 1984; KOJIMA et al.,1982). Fibras e terminais imunorreativos na literatura são observados em todos os níveis da medula espinal através da substância cinzenta, e fibras
também foram encontradas na substância branca do funículo anterior e funículo lateral (HADJICONSTANTINOU et al., 1984; KOJIMA et al.,1982; HOLMES e WADE, 2004).
É observado a partir das imagens obtidas uma aparente coloração de fibras reativas a 5-HT concentradas nas lâminas mais apicais. Sendo as lâminas I, II e III aparentemente ocupadas por elementos imunorreativos à serotonina.
A literatura descreve abundantes fibras serotoninérgicas em sua lâmina I, diminuindo a quantidade de fibras em relação a lâmina II e III enquanto as lâminas IV, V e VI são esparsamente dotadas de fibras de serotonina. (KOJIMA et al.,1982; KOJIMA et al.,1983). As lâminas I e III são dotadas de um grande número de fibras serotoninérgicas longitudinais, mas apenas algumas fibras são visíveis na lâmina II. Nas lâminas IV e V, observa-se um pequeno número de fibras longitudinais e redes de formação de fibras de serotonina relativamente numerosas (HADJICONSTANTINOU et al.,1984; HAINS et al., 2002; PERRIN et al., 2011).
6.5. Estereologia
Em nossa pesquisa foi observado uma constância nos valores da substância cinzenta, branca, coluna posterior e volume total da medula espinal por idade. Não encontrando na literatura, dados que corroborassem com os nossos achados na medula espinal. Porém, encontramos estudos sobre a quantificação de neurônios do neocórtex entre humanos, utilizando o método dissector optico (PAKKENBERG e GUNDERSEN, 1997), que também não apresenta diferença entre idade. Estudos estereológicos, em cerebelos de humanos, demostram dados significativos em comparação entre faixas etárias, apenas no lobo anterior, onde foi encontrada uma perda seletiva de 40% das células de Purkinje e uma perda de volume cortical de 30%, sendo envolvido predominantemente no controle motor (ANDERSEN et al., 2003). Outro estudo revela perda não significativa de neurônios hipotalâmicos de macaco rhesus (ROBERTS et al.,2012), indicando que há perda de neurônios com a idade, mas essa perda é de menor magnitude do que se supunha anteriormente, não podendo explicar déficits relacionados à idade na função hipotalâmica.
Nosso estudo evidência uma estabilidade entre as faixas etárias, apresentando uma hipertrofia da substância cinzenta (14,30%), branca (20,06%), do volume total da medula espinal (17,98%) e da coluna posterior (7,07%), em animais idosos. A literatura demostra
alguma perda não significativa de neurônios com a idade. Porém apresenta um aumento do número de células da glia com a idade (PAKKENBERG et al., 2003; TERRY et al., 1987). O que pode explicar o aumento da substância cinzenta e branca em relação a idade no nosso estudo.
Observamos alteração volumétrica significativa no volume total da medula espinal entre os grupos macho (adulto/jovem) e fêmea (adulta/jovem), apresentando um valor de p de 0,045. Apresentando uma hipertrofia de 20,81% do volume total da medula espinal de fêmeas adultas/jovens comparada aos machos adultos/jovens. Não foi encontrado na literatura dados estereológicos que corroborassem com os achados da nossa pesquisa. No entanto, pesquisas relacionadas a quantificação de neurônios no neocórtex humano (PAKKENBERG e GUNDERSEN, 1997), no hipocampo de esquilos (LAVENEX et al., 2000) e hipotálamo de macacos rhesus (ROBERTS et al.,2012) demostraram um aumento não significativo da quantidade de neurônios presentes nas espécies machos em relação as fêmeas. Dimorfismos sexuais significativos, na literatura, são apresentados quando analisados estereologicamente as regiões do corpo caloso de ratos (AL QATTAN et al., 2019). Apresentando, em machos, uma maior densidade em axônios mielinizados do tronco, na região posterior, enquanto as fêmeas apresentaram uma maior densidade de axônios mielinizados na região anterior do tronco do corpo caloso. No joelho do corpo caloso as fêmeas apresentaram uma maior densidade de axônios não mielinizados, enquanto no esplênio houve uma densidade total e densidade de axônios não mielinizados.
A maioria dos dados obtidos na literatura demostra estabilidade na análise estereológica, sendo os dados significantes se concentram no corpo caloso de ratos, porém, os achados do nosso estudo apontam uma característica morfológica importante de hipertrofia da substância cinzenta da medula espinal de saguis fêmeas, Além de um aumento significativo da medula espinal do volume total da medula espinal.
7. CONCLUSÃO
Os resultados do presente trabalho nos permitem chegar a uma estabilidade quanto aos aspectos bidimensionais entre os grupos “adulto/jovem” e “idoso” tanto em média de área (µm²) quanto em lâmina por lâmina. Essa estabilidade é novamente observada quando comparando os grupos “macho” e “fêmea” em toda a coluna posterior e analisando a área dos neurônios lâmina por lâmina.
Observamos uma aparente concentração de fibra reativas a 5-HT nas lâminas I, II e III, sendo corroborado pela literatura em diversos modelos animais.
Em relação ao aspecto tridimensional observamos uma estabilidade na média de volume em µm3 da substância branca, substância cinzenta, coluna posterior e volume total da medula espinal de saguis comparando o grupo adulto/jovem macho e o idoso macho, assim como na comparação entre os grupos gêneros, em relação a substância branca, substância cinzenta e a coluna posterior. Obtendo diferença significativa no volume total da medula espinal entre os grupos de gênero.
O presente estudo apresenta como uma continuidade a necessidade de uma maior caracterização neuroquímica da coluna posterior do sagui, utilizando Anti-substância P, anti- encefalina e outros imunomarcadores provavelmente encontrados. Em relação à estereologia, há necessidade da realização do método dissector óptico para quantificação de neurônios da substância cinzenta e corno posterior dos animais estudados.
8. DIFICULDADES TÉCNICAS
Houve no decorrer da coleta de dados tivemos alguns obstáculos relacionadas a imunoistoquimica, como a dificuldade de adquirir Anti-substância P e anti-encefalina. Além de termos dificuldade na técnica de fixação da única fêmea idosa que conseguimos devido a uma morte natural inesperada do animal e como nossa coleta se baseia no reaproveitamento de animais, não houve oportunidade de receber mais fêmeas idosas para o nosso estudo.
9. REFERÊNCIAS
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