Précédemment, nous avons vu que, chez les organismes modèles, les protéines THAP sont impliquées dans la régulation du cycle cellulaire et la prolifération. Cette fonction a été confirmée chez l’homme et nous allons voir que les protéines THAP humaines, hTHAP5, hTHAP11 et hTHAP1, sont impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire.
hTHAP5
La protéine hTHAP5 est une protéine nucléaire de 395 acides aminés renfermant, dans sa séquence, un domaine THAP dans la partie N-terminale et un domaine « coiled coil » en position C- terminale (Figure 42A). Le gène hTHAP5 est essentiellement exprimé dans les cellules cardiaques mais on retrouve aussi la protéine hTHAP5 sous forme de traces dans des cellules du muscle ou encore dans des cellules du cerveau (Figure 42B).
La protéase Omi/HtrA2 est une protéase mitochondriale, qui, lorsqu’elle est relarguée dans le cytoplasme, entraîne l’apoptose. En recherchant de nouveaux substrats de la protéase Omi/HtrA2, la protéine THAP5 a été identifiée. Pendant l’apoptose, la protéine hTHAP5 est dégradée spécifiquement par la protéase Omi/HtrA2. Si l’on ajoute un inhibiteur spécifique de la protéase Omi/HtrA2, hTHAP5 n’est plus dégradée, ce qui réduit considérablement le phénomène apoptotique. Dans le but de comprendre la fonction de cette protéine, hTHAP5 a été surexprimée dans des cellules cardiaques. Cette surexpression conduit à un blocage de la division cellulaire et à une accumulation des cellules en phase G2/M. La protéine hTHAP5 contrôle donc la progression du cycle cellulaire dans les cellules cardiaques, et, joue un rôle d’inhibiteur de la prolifération dans ces cellules. De plus, l’analyse de tissus issus de patients souffrants de maladies cardiaques, de type infarctus du myocarde, a permis de mettre en évidence que le taux d’expression de la protéine hTHAP5 est relativement bas dans les régions nécrosées ayant subi l’infarctus ; ce qui suggère une relation importante entre cette protéine hTHAP5 et l’apparition de maladies cardiaques (Balakrishnan et al., 2009).
Figure 42 : hTHAP5 est un régulateur du cycle cellulaire dans les cellules cardiaques.
(A) Schéma général de l’organisation de la protéine hTHAP5. (B) Recherche de l’ARNm de hTHAP5 dans différents tissus,
expériences de Northern blot. On peut voir que hTHAP5 est essentiellement exprimée dans les cellules cardiaques. (C) Recherche de la protéine hTHAP5 dans des cellules extraites de patients souffrant de maladies des artères coronaires (CAD). Différentes zones ont été explorées, la zone de l’infarctus du myocarde (notée CAD-MI), la zone bordant la lésion due à l’infarctus (notée CAD-BZ) et une zone située en dehors de la zone nécrosée par l’infarctus (CAD-RZ). (Balakrishnan et al., 2009)
hTHAP11
Récemment, une étude a montré que la protéine hTHAP11 est exprimée de façon ubiquitaire dans les tissus sains chez l’homme, alors qu’elle est sous exprimée dans certains types de cellules cancéreuses. De façon intéressante, la surexpression de hTHAP11 dans des cellules saines et même cancéreuses entraîne une perte de la croissance cellulaire ; suggérant un rôle important de cette protéine dans la croissance cellulaire et la prolifération. Au contraire, la perte d’expression de hTHAP11 dans des cellules de type HepG2 (Human hepatocellular Liver Carcinomia Cell Line) entraîne une perte de la répression de croissance cellulaire. Tous ces résultats suggèrent que hTHAP11 pourrait être un régulateur physiologique de la prolifération cellulaire. En effet, hTHAP11 permet de contrôler le cycle cellulaire en réprimant la transcription du gène c-Myc, un facteur de transcription clé pour la progression du cycle cellulaire. La répression de l’expression du gène c-Myc est dépendante de l’activité de liaison à l’ADN de hTHAP11. Des expériences d’immunoprécipitation de chromatine et de gel retard ont permis
de montrer que hTHAP11 se lie sur le promoteur c-Myc in vivo et in vitro. Il a ensuite été montré dans différents modèles cellulaires, que la surexpression de hTHAP11 conduit à une inhibition de la prolifération cellulaire qui peut être partiellement levée si c-Myc est aussi surexprimé dans ces cellules (Figure 43A-B). Des expériences réalisées en utilisant des fibroblastes primaires sauvages ou doublement délétés pour le gène c-myc ont permis de mettre en évidence l’inhibition de la prolifération médiée par hTHAP11 (Figure 43C). Tous ces résultats montrent que la protéine hTHAP11 est impliquée dans l’inhibition de la prolifération cellulaire via une répression de l’expression du gène c-myc. hTHAP11 est donc une protéine THAP impliquée dans la prolifération cellulaire et la surexpression de hTHAP11 dans certains types de cancers en font un oncogène d’intérêt (Zhu et al., 2009).
Figure 43: Inhibition de la prolifération cellulaire médiée par hTHAP11 et c-Myc.
(A) Western blot montrant l’expression de hTHAP11 et de c-Myc dans des cellules transfectées par les vecteurs pIRES (contrôle), pIRES-hTHAP11 (permettant la surexpression de hTHAP11) et pIRES-hTHAP11-cMyc (permettant la surexpression de hTHAP11 et de c-Myc). (B) Nombre moyen de colonies observées 14 jours après la transfection des cellules par les différents vecteurs. (C) Surexpression de hTHAP11 dans des lignées de fibroblastes embryonnaires sauvages (Myc +/+) ou doublement délétées des gènes codant pour c-Myc (Myc -/-). La croissance cellulaire est suivie en utilisant la densité optique à 490nm. L’échelle des abscisses est en jours. (Zhu et al., 2009)
hTHAP1
La protéine hTHAP1 est une protéine nucléaire de 213 acides aminés dans laquelle on trouve, en position N-terminale, un domaine THAP et, en position C-terminale, un domaine « coiled coil ». La fonction de la protéine hTHAP1 a été étudiée dans des cellules endothéliales primaires qui expriment naturellement hTHAP1.
Dans un premier temps, la surexpression de hTHAP1 ou l’abolition de l’expression de hTHAP1 ont été réalisées dans des cellules endothéliales primaires humaines (Figure 44). Dans chacun des cas, les cellules voient leur taux de prolifération diminuer. Il apparaît donc qu’une modification du taux d’expression de hTHAP1 dans les cellules endothéliales primaires bloque ces cellules dans le cycle cellulaire et, plus particulièrement, dans la phase G1 du cycle cellulaire. En effet, une analyse de la répartition des cellules après traitement montre que la population cellulaire en G1 croît. La protéine hTHAP1 est donc un régulateur endogène de la prolifération des cellules endothéliales primaires et contrôle le passage des cellules dans la transition G1/S (Cayrol et al., 2007). Dans le but de comprendre comment s’effectue le contrôle de la transition G1/S par hTHAP1 dans les cellules endothéliales primaires, une analyse différentielle du transcriptome de ces cellules en conditions normales, puis après transfection d’un plasmide permettant la surexpression de hTHAP1, a été réalisée. Il apparaît que certains gènes voient leurs taux d’expression varier lorsque hTHAP1 est surexprimée. On retrouve notamment des gènes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire et, plus particulièrement, une majorité des gènes identifiés est sous le contrôle de la voie pRb/E2F. L’identification de ces gènes dérégulés a été confirmée par des expériences de qPCR qui ont montré une modification du taux d’expression de ces gènes lorsque hTHAP1 est surexprimée. Il en est de même lors de l’abolition de l’expression de hTHAP1 dans ces cellules. On observe une diminution de la prolifération associée à une diminution de l’expression des gènes contrôlés par la voie pRb/E2F. D’après ces résultats, la protéine hTHAP1 apparaît donc comme un nouveau facteur de transcription contrôlant l’expression de certains gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire via la voie pRb/E2F (Cayrol et al., 2007). Ces résultats sont en accord avec les données recueillies chez les organismes modèles. On observe donc un lien étroit entre la progression dans le cycle cellulaire (transition G1/S) et la protéine hTHAP1. Plus précisément, il semble que la protéine hTHAP1 doit être exprimée à un taux bien défini afin de permettre la prolifération des cellules endothéliales primaires puisqu’une modification de l’expression de hTHAP1 dans ces cellules entraîne un blocage en G1 (Cayrol et al., 2007).
Figure 44 : Effet de la surexpression ou de perte d’expression de hTHAP1 dans les cellules endothéliales primaires.
(A) Mise en évidence par Western Blot de la surexpression de hTHAP1 dans les cellules endothéliales primaires transfectées par le vecteur permettant la surexpression de hTHAP1. Mise en évidence de l’arrêt de la prolifération dû à la surexpression de hTHAP1. (B) Répartition des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire après transfection d’un vecteur vide et d’un vecteur permettant la surexpression de hTHAP1. (C) Analyse différentielle de l’expression des gènes contrôlés par la voie pRb/E2Faprès surexpression de hTHAP1. Les résultats obtenus par puces à ADN sont représentés par les barres blanches et les résultats obtenus par qRT-PCR sont représentés par les barres noires. (D) Effet de la perte de l’expression de hTHAP1 dans des cellules endothéliales primaires sur la croissance cellulaire. (E) Répartition des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire après la perte d’expression de hTHAP1. (F) Analyse différentielle l’expression des gènes contrôlés par la voie pRb/E2F après la perte d’expression de hTHAP1 dans les cellules endothéliales (Cayrol et al., 2007).
Parmi les gènes régulés par hTHAP1, le gène RRM1, codant pour la protéine Ribonucléotide Réductase M1, est un gène essentiel pour la synthèse d’ADN pendant la phase S du cycle cellulaire, phase de duplication de l’ADN. Ce gène présente au niveau de son promoteur des sites de liaison pour des facteurs de transcription : un site pour la liaison du facteur E2F, un site pour la liaison du facteur NF-Y et deux sites de liaison THABS pour la fixation de la protéine hTHAP1 (Figure 45A). L’association entre la protéine hTHAP1 et le promoteur du gène RRM1 a été mise en évidence in vivo grâce à des expériences d’immunoprécipitation de chromatine (Figure 45B). In vitro, l’interaction a été vérifiée en utilisant les techniques de gel retard (Figure 45C) mais aussi de « footprint » par la DNAse I. Ces résultats font du gène RRM1, le premier gène cible de hTHAP1 validé in vivo et in vitro (Cayrol et al., 2007).
Figure45 : Fixation de hTHAP1 sur le promoteur du gène RRM1.
(A) Séquence du promoteur du gène RRM1, les lettres majuscules représentent la partie qui sera transcrite en ARNm et le
codon ATG est représenté en gras. Les sites de liaison de hTHAP1, NF-Y et E2F sont aussi indiqués. (B) Résultats des expériences d’immunoprécipitation de chromatine dirigée contre hTHAP1. La présence de deux promoteurs a été recherchée, le promoteur du gène RRM1 et le promoteur du gène NF-YA dans lequel on retrouve un site de liaison pour le facteur de transcription NF-YB. Ce facteur de transcription est le contrôle positif puisqu’il est sensé être immunoprécipité sur les deux promoteurs. Enfin, une immunoprécipitation réalisée avec un anticorps anti-flag sert de contrôle négatif (Cayrol et al., 2007).
D’autre part, une étude récente a permis de mettre en évidence des partenaires protéiques de hTHAP1 lors de sa fixation sur le promoteur du gène RRM1 (Mazars et al., 2010). hTHAP1 est capable de s’associer avec HCF-1, une protéine co-activatrice. Cette interaction fait intervenir une séquence consensus nommée HBM (HCF-1 Binding Motif) de quatre acides aminés (D/EHxY) qui est présente en amont du domaine « coiled coil » de la protéine hTHAP1 (Figure 46A). De plus, des protéines présentant un motif HBM muté sont incapables de s’associer avec HCF-1. Ce motif HBM est retrouvé dans la plupart des protéines THAP humaines, mais aussi chez certaines protéines THAP d’organismes modèles. Ceci suggère que la plupart des protéines THAP peuvent interagir avec HCF-1, cependant la démonstration expérimentale n’a été faite que pour hTHAP1, hTHAP3 et mTHAP11. HCF-1 est une protéine abondante dans le noyau, associée à la chromatine et jouant un rôle critique dans la prolifération cellulaire (Goto et al., 1997, Julien and Herr, 2003). C’est une protéine multi-domaine de 2035 acides aminés présentant dans sa partie N-terminale un domaine Kelch qui est impliqué dans la reconnaissance de la boîte HBM comme cela a été démontré pour l’interaction entre HCF-1 et E2F4 (Knez et al., 2006) alors que le reste de la protéine est impliqué dans le recrutement d’effecteurs transcriptionnels (Mangone et al., 2010).
Outre HCF-1, hTHAP1 est aussi capable de s’associer, probablement de façon indirecte, avec OGT (O-GlcNAc Transferase) une enzyme capable de générer des ajouts de groupements N-Acétyl- Glucosamine sur d’autres protéines. In vivo, hTHAP1 va recruter HCF-1 et OGT sur le promoteur du gène RRM1, comme l’ont montré des expériences d’immunoprécipitation de chromatine. De façon intéressante, sur le promoteur RRM1, on observe les sites THABS mais aussi un site de liaison pour les facteurs E2Fs. Cependant, des expériences d’immunoprécipitation de chromatine réalisées en immunoprécipitant hTHAP1 ou HCF-1 montrent clairement que c’est hTHAP1 qui assure le recrutement de HCF-1 au niveau du site THABS présent sur le promoteur du gène RRM1 (Figure 46B). De plus, la suppression de l’expression de HCF-1 entraîne une réduction de la quantité d’ARNm RRM1 comme le montrent les résultats obtenus après transfection d’un siRNA dirigé contre HCF-1 dans des cellules endothéliales et quantification de l’ARNm RRM1 par qPCR (Figure 46C). HCF-1 est donc un partenaire essentiel de hTHAP1 qui permet d’activer la transcription du gène RRM1.
Figure 46 : hTHAP1 et HCF-1 sont associés sur le promoteur du gène RRM1 et HCF-1 est essentiel pour activer la transcription du gène RRM1.
(A) Alignement de séquences montrant la conservation du motif HBM (D/EHxY) dans les protéines THAP humaines. Sur la droite, le motif HBM est représenté par une étoile sur les schémas représentant les protéines THAP. (B) Expériences d’immunoprécipitation de chromatine recherchant la présence du promoteur RRM1. Pour ce faire, hTHAP1 ou HCF-1 ont été spécifiquement immunoprécipitées puis la présence du promoteur RRM1 a été recherchée en utilisant la technique de qPCR et trois paires d’oligonucléotides différentes. (C) Effet de la délétion de l’expression de HCF-1 dans des cellules endothéliales primaires sur l’expression du gène RRM1 (Mazars et al., 2010).
Avec l’étude de hTHAP1 et hTHAP11, la fonction des protéines THAP humaines commence à être comprise. Il semble donc que les protéines THAP soient des facteurs de transcription qui permettent le ciblage des gènes dont il faut réguler l’expression à un instant donné dans la cellule. Ce ciblage est réalisé par l’intermédiaire du domaine THAP qui apparaît comme un nouveau domaine de liaison à l’ADN. Nous avons vu que les domaines THAP de hTHAP1, de hTHAP11 et de dmTHAP (domaine THAP de la transposase de l’élément P chez D. melanogaster) reconnaissent des cibles ADN différentes. Chaque domaine THAP semble donc avoir une spécificité de reconnaissance particulière, ce qui pourrait permettre à chaque protéine THAP de cibler différents gènes pour en réguler leur expression. De façon surprenante, seul le domaine THAP de la protéine hTHAP7 a été décrit comme un module d’interaction protéine-protéine (Macfarlan et al., 2005, Macfarlan et al., 2006), il pourrait avoir dévié de sa fonction initiale au cours de l’évolution. Cependant, le ciblage de l’ADN n’est pas suffisant pour entraîner une régulation transcriptionnelle. Une fois fixée sur le promoteur du gène cible, une protéine THAP devra recruter des effecteurs permettant la régulation de la transcription. Nous avons vu que la plupart des protéines THAP possède dans leurs séquences un motif de liaison à HCF-1 et que les protéines hTHAP1 (Mazars et al., 2010), hTHAP3 (Mazars et al., 2010) et mTHAP11 (Dejosez et al., 2008) sont capables de recruter ce facteur afin de réguler la transcription. Alors que dans le cas de mTHAP11, on observe une répression de la transcription médiée par HCF-1. Dans le cas de hTHAP1, le recrutement de HCF-1 au niveau du promoteur RRM1 permet l’activation de la transcription du gène (Mazars et al., 2010). Ceci suggère que la régulation de la transcription médiée par les protéines THAP est un phénomène complexe qui n’est pas uniquement lié à la présence d’une protéine THAP et de HCF-1, d’autres protéines partenaires ou régulatrices doivent être recrutées et leur identification permettra d’avoir une vision complète du processus. La recherche de partenaires protéiques de hTHAP1 régulant la transcription au niveau du promoteur RRM1 a aussi permis d’identifier la protéine OGT. Cette protéine est capable de transférer un groupement N-Acétyl-Glucosamine jouant le rôle de modification post traductionnelle. Il est donc vraisemblable que la protéine OGT puisse réguler le recrutement des partenaires protéiques de HCF-1 par l’intermédiaire de modification post- traductionnelle afin de moduler le recrutement des partenaires activateurs ou répresseurs de la transcription. La recherche des protéines partenaires de hTHAP3 a aussi permis d’identifier HCF-1 et OGT (Mazars et al., 2010). Et, dans ce cas, différentes formes de HCF-1 ont été identifiées, dont certaines présentent des peptides O-Glycosylés, laissant penser que OGT puisse réguler l’activité de HCF-1 en modifiant son état de glycosylation (Mazars et al., 2010). Cependant, après transfection d’un siRNA spécifiquement dirigés contre OGT dans des cellules endothéliales primaires humaines, on
n’observe pas de modification dans l’expression du gène RRM1, suggérant que la protéine OGT n’est pas impliquée dans le cas de la régulation de l’expression du gène RRM1 (Mazars et al., 2010).
Un autre point, qu’il est aussi important de souligner, concerne le promoteur RRM1. Ce promoteur présente deux sites de reconnaissance pour hTHAP1. Nous ne pouvons pas exclure que hTHAP1 se lie sous forme de dimère (voire même d’hétérodimère) sur ce promoteur. De plus, la partie C-terminale de hTHAP1 renferme un domaine « coiled coil » et ce type de domaine est fréquemment impliqué dans des phénomènes de dimérisation.
Ces études fonctionnelles permettent donc de faire un lien fort entre la régulation du cycle cellulaire et les protéines THAP. Elles permettent de comprendre comment se déroule la régulation transcriptionnelle médiée par les protéines THAP. La protéine THAP assure le ciblage de la régulation en utilisant son domaine THAP pour reconnaître spécifiquement l’ADN. Ensuite, elle recrute HCF-1 qui joue le rôle d’effecteur transcriptionnel probablement en recrutant des protéines partenaires (Figure 47).