Rôle des partenaires ESCRT d’Alix dans la CIE de la CTxB

Comme nous venons de le voir, l’interaction d’Alix avec Tsg101 (ESCRT I) ne semble pas requise pour la fonction d’Alix dans la CIE de la CTxB. En ce qui concerne l’interaction d’Alix avec CHMP4 (ESCRT III), le résultat est ambigu puisque nous avons observé une restauration partielle de l’internalisation de la CTxB. Afin de statuer sur la fonction des protéines ESCRT (plus particulièrement ESCRT III, CHMP4) dans la CIE, nous avons étudié en microscopie, la colocalisation éventuelle des ESCRT, ainsi que des mutants d’Alix délétés des sites d’interaction avec ESCRT I (Tsg101) ou avec ESCRT III (CHMP4), avec les patchs formés par la CTxB à 4°C.

Figure 44: Effet des différents mutants d’Alix sur l'internalisation de la CTxB

Les MEF ko Alix ont été infectées avec un virus codant pour différentes constructions d’Alix et l’internalisation de la CTxB (5 minutes à 37°C) a été quantifiée via imageJ dans les cellules exprimant ces constructions. n=4, 120 cellules *p<0.05 ; **p<0.02 ; ***p<0.001

135 Pour cela, nous avons dans un premier temps transfecté des MEF wt avec la construction GFP-CHMP4 ou la construction GFP-Tsg101 que nous avons ensuite incubées à 4°C avec la CTxB. Les résultats obtenus (Figure 45) révèlent que ni CHMP4 ni Tsg101 ne sont recrutées aux patchs CTxB lors de l’ajout de la toxine. Nous avons également transfecté des MEF ko Alix avec le mutant d’Alix délété de son site d’interaction avec CHMP4 (AlixΔCHMP4) ou le mutant d’Alix délété de son site d’interaction avec Tsg101 (AlixΔTsg101) et incubé ces cellules avec la CTxB à 4°C. Nous avons observé qu’AlixΔCHMP4 et AlixΔTsg101 sont recrutées normalement aux patchs de CTxB de façon comparable à Alix wt (Figure 45). L’ensemble de ces résultats suggèrent donc que la fonction d’Alix dans l’internalisation de la CTxB est indépendante de l’interaction d’Alix avec ses partenaires ESCRT.

B A

C

D

E

Figure 45: CHMP4 et Tsg101 ne sont pas recrutés aux zones de la membrane enrichies en CTxB à 4°C et l’interaction d’Alix avec ces protéines n’est pas nécessaire pour le recrutement d’Alix aux patchs de CTxB

A,C) MEF transfectées avec GFP-CHMP4 (A) ou GFP-Tsg101 (C) pendant 12 heures et incubées 20 minutes à 4°C avec la CTxB-TRITC.

B,D) MEF ko Alix transfectées 24 heures avec AlixΔCHMP4-Flag (B) ou AlixΔTsg101-Flag (D) et incubées 20 minutes à 4°C avec la CTxB-TRITC.

F) Quantification, via ImageJ, du nombre de patchs de CTxB qui concentrent les différentes protéines transfectées. n=3, 60 cellules, p***<0.001

136 Parallèlement à ces expériences, nous avons analysé l’effet de la déplétion de CHMP4 sur l’internalisation de la CTxB dans les MEF wt et ko Alix. Pour ce faire, nous avons transfecté les MEF wt et ko Alix avec un shContrôle (scl) ou un shCHMP4-GFP (shCHMP4) pendant 72 heures et avons analysé l’internalisation de la CTxB aprés 5 minutes à 37°C (Figure 46). Les résultats que nous avons obtenus montrent que la déplétion de CHMP4 n’a pas d’effet sur l’internalisation de la CTxB dans les cellules wt. Par contre, de façon surprenante, la déplétion de CHMP4 semble restaurer l’internalisation de la CTxB dans les cellules ko Alix, suggérant que CHMP4 agit comme un inhibiteur de l’internalisation de la CTxB en absence de la protéine Alix. Une étude plus poussée du rôle de CHMP4 dans l’internalisation de la CTxB devra être menée afin de pouvoir conclure sur le rôle de cette protéine dans ce processus.

Figure 46: Effet de la depletion de CHMP4B sur l’internalisation de la CTxB

Les cellules wt ou ko Alix ont été transfectées 72 heures avec un shContrôle (scl) couplé à la GFP ou avec un shCHMP4 couplé à la GFP. Les cellules ont été incubées en présence de CTxB-TRITC pendant 20 minutes à 4°C, rincées puis placées 5 minutes à 37°C afin d’induire l’internalisation de la toxine. La valeur moyenne de fluorescence de la CTxB par cellule transfectée a été mesurée via ImageJ. n=2, 40 cellules, p***<0.001

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139 Alix est une protéine cytoplasmique, adaptatrice, qui a été impliquée dans de nombreux processus cellulaires tels que l’endocytose, l’apoptose, la cytokinèse, la réparation membranaire ou encore le bourgeonnement des virus à la membrane plasmique (Sadoul et al., 2006, Jimenez et al., 2014). La plupart des interacteurs connus d’Alix sont des protéines impliquées dans l’endocytose. Parmi ces partenaires, Alix interagit notamment avec les complexes ESCRT-I et ESCRT-III, et le LBPA ce qui suppose un rôle d’Alix dans la formation des ILV (Strack et al., 2003 ; Katoh et al., 2003 ; Bissig et al., 2004 . Cependant, chez les mammifères, la déplétion d’Alix n’a pas d’effet majeur sur la dégradation de l’EGFR (Cabezas et al., 2005; Chevallier et al., 2008). Plus récemment, une fonction d’Alix dans le processus de back fusion, a été proposée (Bissig et al., 2013). La back fusion permet à une ILV déjà formée de fusionner avec la membrane limitante de l’endosome afin d’expulser du matériel ne devant pas être dégradé. Alix pourrait, lorsqu’elle se lie au LBPA, insérer une boucle hydrophobe dans la membrane endosomale et ainsi faciliter la fusion de l’ILV avec la membrane limitante de l’endosome (Bissig et al., 2013).

Dans cette étude, nous avons utilisé des MEF ko Alix afin de clarifier la fonction cellulaire de la protéine Alix et plus particulièrement sa fonction dans la voie endolysosomale. Pour ce faire, nous avons analysé la morphologie des compartiments de la voie endocytaire dans les cellules ko Alix. Nous avons également réalisé des tests fonctionnels afin d’analyser l’état de la voie endocytaire dans ces cellules. De façon surprenante, il est apparu au cours de ce travail que les endosomes et en particulier les MVB sont normaux dans les MEF ko Alix et que le trafic endosomal n’est pas altéré. De plus, nous montrons pour la première fois, un effet significatif de la déplétion d’Alix sur la dégradation de l’EGFR. Cependant, il est apparu que, c’est l’étape d’internalisation, à la membrane plasmique qui est affectée par l’absence d’Alix, plutôt que le tri du récepteur au niveau du MVB. Nous avons également constaté que la CIE est spécifiquement affectée par l’absence d’Alix alors que la CME demeure intacte dans les MEF ko Alix. De plus, la protéine Alix ne semble pas impliquée dans une voie CIE particulière puisque l’endocytose de cargos connus pour emprunter des CIE différentes est inhibée dans les MEF ko Alix. Ainsi, nous avons montré que l’internalisation de la phase fluide, du GPI-GFP, de l’intégrine β1, de l’EGF à forte concentration et de la CTxB est affectée par la déplétion d’Alix. Par contre, l’endocytose du récepteur à la transferrine ainsi que celle de l’EGFR à faible concentration semblent normales dans les cellules ko Alix. Les résultats que nous avons obtenus montrent de plus que cette fonction d’Alix dans la CIE est dépendante de sa capacité à lier les endophilines A. Nous avons également observé qu’Alix ainsi que l’endophiline A2 peuvent être recrutées au niveau de régions de la membrane

140 plasmique qui concentrent la CTxB (patch), un marqueur de la CIE. Parallèlement à notre travail impliquant Alix et l’endophiline A2 dans la CIE sortaient deux études impliquant les endophilines dans une nouvelle CIE empruntée notamment par l’EGFR à forte concentration et la CTxB. L’inhibition de la CIE dans les MEF ko Alix a également été associée à des effets physiologiques. Ainsi, nos résultats démontrent que la migration, l’étalement cellulaire et la signalisation de l’IL2R, trois processus connus pour être régulés par la CIE, sont altérés dans les MEF ko Alix.

Dans cette partie, nous allons discuter, dans un premier temps, de l’effet de l’absence d’Alix sur la dégradation du récepteur à l’EGF et la formation des ILV. Dans un deuxième temps, nous nous intéresserons à l’inhibition spécifique de la CIE dans les MEF ko Alix, ainsi qu’au rôle moléculaire que pourrait jouer la protéine Alix et le couple Alix/endophiline dans la CIE. Nous discuterons également de la présence d’Alix à la membrane plasmique et la façon dont elle pourrait y être recrutée. Nous nous intéresserons enfin aux effets physiologiques associés à l’inhibition de la CIE dans les MEF ko Alix et nous finirons par une conclusion générale de l’ensemble de ce travail de thèse.

1. La déplétion d’Alix ralentie la dégradation de l’EGFR sans altérer de façon majeure