Dans cette étude, nous montrons que la dégradation de l’EGFR est retardée dans les MEF ko Alix. L’analyse de la dégradation de l’EGFR suite à la stimulation par l’EGF est un test couramment utilisé dans le domaine de l’endocytose. Ce test permet notamment de voir si le tri du récepteur vers la voie de dégradation se fait convenablement. Comme je l’ai déjà mentionné, au vu de ses interactions avec les complexes ESCRT I et ESCRT III, un rôle d’Alix dans le tri des récepteurs avait été envisagé chez les mammifères, suite à la fonction décrite pour son homologue Bro1 chez la levure. Ainsi, plusieurs équipes de recherche ont analysé la dégradation de l’EGFR dans des cellules déplétées en Alix par des siRNA et ont montré que la déplétion d’Alix n’a pas d’effet majeur sur la dégradation de l’EGFR (Schmidt et al., 2005, Cabezas et al., 2005, Bowers et al., 2006 ; Luyet et al., 2008). Il semble donc que, dans les cellules de mammifères, la protéine Alix ne soit pas indispensable pour le tri de l’EGFR au niveau des ILV. Il a été proposé que HDPTP, un homologue d’Alix pourrait remplir la fonction de Bro1 chez les mammifères puisque sa déplétion affecte fortement la dégradation de l’EGFR et la formation des ILV (Doyotte et al., 2008). Comme je l’ai déjà mentionné, au cours de mon travail de thèse, nous avons observé un retard de la dégradation
141 de l’EGFR dans les MEF ko Alix, ce qui est compatible avec un rôle d’Alix dans la formation des ILV. En effet, nous avons réalisé une cinétique de dégradation de l’EFGR et avons constaté que le récepteur est bel et bien dégradé dans les MEF ko Alix, mais plus lentement que dans les cellules wt. Notre interprétation est que, ce ralentissement de la dégradation de l’EGFR, est dû à une inhibition de son internalisation plutôt qu’à un défaut de tri au niveau du MVB. Cette hypothèse est fondée sur le fait que l’internalisation de l’EGFR à forte concentration est inhibée en absence d’Alix et que la caractérisation morphologique des compartiments de la voie endocytaire, en particulier des MVB, n’a pas permis de mettre en évidence d’anomalies majeures dans les MEF ko Alix. De plus, en suivant le trafic de la BSA-gold le long des compartiments endocytaires, nous avons mis en évidence que le trafic n’est pas bloqué, mais simplement décalé dans le temps, du fait d’un défaut d’internalisation. Le résultat que nous avons obtenu sur l’effet de l’absence d’Alix sur la dégradation de l’EGFR est en désaccord avec les études précédentes (Cabezas et al., 2005 ; Luyet et al., 2008 ; Doyotte et al., 2008). Cette différence pourrait être due au fait que les expériences antérieures ont été réalisées dans des lignées cellulaires de type HeLa (Cabezas et al., 2005 ; Luyet et al., 2008) dans lesquelles la cinétique de dégradation n’est peut-être pas identique à celle observée dans des cellules primaires. La majorité de ces tests de dégradation de l’EGFR ont été réalisés sur des temps longs de stimulation à l’EGF, typiquement de l’ordre de 6 heures (Cabezas et al., 2005 ; Luyet et al., 2008). Nous montrons que la dégradation de l’EGFR n’est pas bloquée par l’absence d’Alix, de ce fait il est envisageable qu’un effet de la déplétion d’Alix sur la dégradation de l’EGFR dans des cellules de type HeLa ait pu être observé sur des temps plus courts de stimulation à l’EGF. De plus, nous ne pouvons pas exclure le fait qu’un modèle de cellules ko ne soit pas identique à un modèle utilisant des siRNA. En effet, dans les MEF ko Alix, la déplétion de la protéine Alix est totale alors qu’elle ne l’est pas dans des cellules traitées par siRNA. Même si le niveau d’expression d’Alix après traitement des cellules par siRNA est très faible, il est peut être toujours suffisant pour assurer certaines fonctions de la protéine.
En accord avec nos résultats, une étude récente a démontré que la dégradation de l’EGFR est ralentie par la déplétion d’Alix (Sun et al., 2014). Il a été montré dans ce travail que la stimulation, de l’EGFR par l’EGF, induit l’interaction d’Alix, au niveau de son v-domaine, avec le récepteur ubiquitiné, la dimérisation d’Alix et l’augmentation de l’interaction d’Alix avec CHMP4 au niveau de l’endosome. L’inhibition, de l’interaction d’Alix avec CHMP4, de la dimérisation d’Alix ou l’extinction d’Alix par des siRNA ralentissent la dégradation de l’EGFR et prolongent sa signalisation (Sun et al., 2014). Pour les auteurs de cette étude,
142 l’effet de la déplétion d’Alix serait donc lié à un déficit de formation des ILV. Cependant, dans ce travail, il n’y a pas d’observation en microscopie électronique permettant de valider cette hypothèse. De plus, les auteurs n’ont pas vérifié l’internalisation de l’EGFR dans leurs cellules déplétées en protéine Alix.
Il est important de noter que dans cette étude, les auteurs ont utilisé deux protocoles différents pour analyser l’effet de la déplétion d’Alix sur la dégradation de l’EGFR. En effet, ils ont soit réalisé une stimulation continue à l’EGF (le protocole que nous avons utilisé), soit un pulse-chase à l’EGF. De façon intéressante, l’effet de la déplétion d’Alix sur la dégradation de l’EGFR est beaucoup plus marqué lors de la stimulation continue à l’EGF alors qu’il n’est visible que pendant la première heure lors de l’expérience de pulse-chase (Sun et al., 2014). Ce résultat pourrait expliquer le fait qu’aucun effet de la déplétion d’Alix n’ait été observé sur la dégradation de l’EGFR dans les études antérieures, puisque la plupart ont utilisé le protocole de pulse- chase à l’EGF (Cabezas et al., 2005 ; Doyotte et al., 2008 ; Luyet et al., 2008).
Il a été proposé que la protéine Alix régule la formation des ILV chez les mammifères, via son interaction avec le LBPA (Matsuo et al., 2004). De plus, la déplétion d’Alix, par des siRNA, dans des cellules BHK, entraine une diminution du LBPA à la membrane de l’endosome ainsi que l’apparition de MVB dépourvues d’ILV (Chevalier et al., 2008). Lors de notre caractérisation des MEF ko Alix, nous n’avons pas constaté d’anomalies majeures de la morphologie des MVB. En effet, notre étude en microscopie électronique a montré que la morphologie des MVB des MEF ko Alix semble normale, puisque les MVB contiennent des ILV et présentent une taille comparable au MVB des cellules wt. De plus, le cholestérol comme le LBPA, présentent la même distribution et intensité de marquage en microscopie de fluorescence dans les cellules wt et les cellules ko Alix.
Cependant, il est important de noter que nous avons constaté une diminution de 20% du nombre d’ILV par MVB dans les cellules ko Alix par rapport aux cellules contrôles. Cette différence pourrait être compatible avec le retard de la dégradation de l’EGFR que nous avons observé dans notre étude et de ce fait, à un rôle d’Alix dans la formation des ILV. Cependant, l’effet que nous observons sur la dégradation de l’EGFR est, selon notre hypothèse, lié à l’inhibition de l’internalisation de l’EGFR. De plus, cette légère diminution du nombre d’ILV par MVB est compatible avec un rôle d’Alix dans le phénomène de back fusion, comme il a récemment été proposé (Bissig et al., 2013). En effet, de façon intéressante, Alix et le LBPA sont impliqués dans la back fusion, qui signifie que l’ILV après avoir été formé va pouvoir fusionner avec la membrane de l’endosome et libérer sont contenu dans le cytoplasme. Ce
143 processus est utilisé par certain virus pour éviter l’environnement acide du MVB (Abrami et al., 2004 ; Leblanc et al., 2005 ; Abrami et al., 2013 ; Bissig et al., 2013). La liaison d’Alix avec le LBPA à la membrane de l’endosome induirait un changement de conformation d’Alix, lui permettant d’insérer une boucle hydrophobe dans la membrane. Cette insertion d’Alix aurait pour effet de décaler les glycoprotéines enchassées dans la membrane endosomale et ainsi créer une portion de membrane libre permettant la fusion de l’ILV avec la membrane endosomale (Bissig et al., 2013). Il est probable que la déplétion d’Alix affecte ce processus de back fusion et impacte donc le nombre d’ILV par MVB. Toutefois, la baisse du nombre d’ILV par MVB dans les MEF ko Alix pourrait aussi être le reflet de l’inhibition de l’internalisation de l’EGFR puisqu’il est connu que l’EGF peut stimuler la formation des ILV (Futter et al., 1996).