144 3.1 Alix/CIN85
Un rôle d’Alix dans l’internalisation de l’EGFR a déjà été suggéré, bien que démontrant un effet inverse à nos résultats. En effet, Schmidt et al, ont observé que l’inhibition de l’expression d’Alix par des siRNA, induit une augmentation de l’internalisation de l’EGFR à forte concentration (50 ng/ml) (Schmidt et al., 2004). D’un autre coté, la surexpression d’Alix est associée à une inhibition de cette internalisation. Il est important de noter que la majorité des expériences réalisées dans cette étude ont été faites sur des cellules de lignée surexprimant l’EGFR, ce qui peut modifier son comportement. L’interprétation de Schmidt et al, est qu’Alix surexprimée bloque l’interaction de Cbl avec CIN85 en séquestrant le couple CIN85-endophiline empêchant de ce fait leur interaction avec Cbl. Il a récemment était montré que ces protéines ; CIN85, Cbl et les endophilines, sont impliquées dans la voie FEME (CIE dépendante des endophilines) qui prend notamment en charge l’EGFR à forte concentration (Boucrot et al., 2014). De plus, lors de nos expériences de restauration de l’internalisation de la CTxB dans les MEF ko Alix, nous avons observé que le mutant d’Alix ne pouvant lier CIN85 (AlixΔCIN85) ne restaure pas l’internalisation de la toxine. Il semble donc que l’interaction d’Alix avec CIN85 est effectivement impliquée dans l’internalisation et plus spécifiquement dans la CIE. Cependant, afin de confirmer le rôle spécifique de l’interaction d’Alix avec CIN85 dans la CIE, il faudrait analyser l’endocytose de la transferrine dans les MEF ko qui expriment AlixΔCIN85 ainsi que l’endocytose de la CTxB et de l’EGF à faible et forte concentration dans des MEF wt déplétées en protéine CIN85. Il serait également intéressant de voir si CIN85 est recrutée, comme Alix et les endophilines, aux patchs de CTxB à 4°C, à la membrane plasmique.
3.2 Alix/endophilines
Nos données montrent que l’implication d’Alix dans la CIE est dépendante de sa capacité à lier les endophilines, au moins en ce qui concerne la CIE de la CTxB. Deux études récentes ont également impliqué les endophilines dans la CIE de la CTxB ainsi que dans la CIE de l’EGFR (Boucrot et al., 2014 ; Renard et al., 2014). Il est donc envisageable que l’implication d’Alix dans la CIE de l’EGFR requiert également sa liaison aux endophilines. Afin de confirmer cette hypothèse, il serait intéressant de mesurer l’internalisation de l’EGFR dans les MEF ko Alix exprimant un mutant d’Alix délété de son site d’interaction avec les endophilines (AlixΔendophiline). Il serait également intéressant de voir si Alix est recrutée, comme les endophilines (Boucrot et al., 2014), au bord de la cellules après stimulation à forte concentration d’EGF, comme nous l’avons observé lors de l’étude de la CTxB. De plus, il
145 faudrait que nous analysions l’internalisation d’autres cargos (GPI-GFP, EGFR à forte concentration…) dans ces MEF qui expriment AlixΔendophilin, d’autant plus que les GPI-AP n’ont pas été décrits comme empruntant la voie FEME (Boucrot et al., 2014). Enfin, il serait intéressant de vérifier que les autres cargos induisent le recrutement d’Alix et des endophilines à la membrane plasmique, comme nous l’avons montré pour la CTxB.
3.3 Alix/Galectin 3
Alix interagit également avec la Galectin-3 (Chen et al., 2009), une protéine proposée pour jouer un rôle dans l’endocytose de récepteurs décrits pour entrer par la voie CG (Lakshminarayan et al., 2014) ainsi que dans l’endocytose de l’EGFR (Liu et al., 2012). Il a été décrit que l’endocytose et le recyclage de l’EGFR semblent en effet affectés dans des cellules KO pour la Galectine-3 (Liu et al., 2012). Dans cette étude, l’inhibition de l’internalisation de l’EGFR semble être corrélée à une diminution de l’association d’Alix avec l’EGFR. Il serait intéressant d’analyser l’importance de l’interaction d’Alix avec la Galectine-3 dans notre modèle. Cependant, le site d’interaction d’Alix avec la Galectine-Galectine-3 n’est pas connu à l’heure actuelle.
3.4 Alix/ESCRT
La plupart des fonctions cellulaires dans lesquelles sont impliquées Alix dépendent de la capacité d’Alix à lier les protéines ESCRT (bourgeonnement des virus, cytokinèse, réparation membranaire…)(Zhou et al., 2010 ; Morita et al., 2007 ; Jimenez et al., 2014). Nous avons donc pensé à un rôle des protéines ESCRT dans la CIE dépendante d’Alix. En effet, Alix pourrait être nécessaire au recrutement des ESCRT à la membrane plasmique et permettre aux ESCRT de polymériser et de former des protrusions membranaires de part et d’autre du site d’entrée de la toxine. Ce phénomène pourrait ainsi faciliter l’internalisation de CTxB notamment en induisant une augmentation de la tension locale de la membrane plasmique qui faciliterait la fission. Cependant, nous avons montré que Tsg101 n’est pas requis dans l’endocytose de la CTxB puisque l’expression du mutant d’interaction d’Alix avec Tsg101 (AlixΔTsg101) restaure complètement l’endocytose de CTxB dans les MEF ko Alix. De plus, Tsg101 n’est pas recrutée au site d’entrée de la CTxB. Par contre, les résultats que nous avons obtenus concernant le rôle de CHMP4 dans l’internalisation de la CTxB sont moins clairs que ceux obtenus pour Tsg101. En effet, CHMP4 ne semble pas être recrutée aux patchs de la CTxB, pourtant le mutant d’interaction d’Alix avec CHMP4 (AlixΔCHMP4) ne restaure pas complètement l’endocytose de la CTxB. Pour être sur de pouvoir exclure ESCRT III de ce
146 mécanisme, nous avons déplété les MEF wt et ko Alix en CHMP4 avec un sh dirigé contre cette protéine. Là encore les résultats ne sont pas simples à interpréter, puisque la déplétion de CHMP4 dans les cellules wt n’a aucun effet sur l’endocytose de la CTxB (suggérant que CHMP4 n’est pas impliqué) alors que sa déplétion dans les MEF ko Alix a tendance à restaurer l’internalisation de la toxine. Une étude plus poussée du rôle de CHMP4 dans l’internalisation de la CTxB est donc nécessaire afin de pouvoir statuer sur le rôle de cette protéine dans ce processus.
3.5 Alix/actine
La protéine Alix a été impliquée dans le remodelage du cytosquelette d’actine, du fait de son interaction avec l’actine et des protéines qui régulent sa polymérisation (cortactine, FAK, Pyk2…) (Schmidt et al., 2003, 2005 ; Cabezas et al., 2005). La déplétion d’Alix inhibe la formation des fibres de stress (Pan et al., 2006) et conduit à l’accumulation de structures anormales enrichies en actine (Cabezas et al., 2005 ; Bongiovanni et al., 2012). Etant donnée l’importance du cytosquelette d’actine dans la CIE, l’inhibition de la CIE dans les MEF ko Alix pourrait résulter d’une dérégulation du cytosquelette d’actine. De plus, Alix interagit également avec CD2AP, un orthologue de CIN85, qui couple le cytosquelette d’actine à l’endocytose de certains récepteurs membranaires (Monzo et al., 2005). Cependant, nous n’avons pas observé de perturbation majeure du cytosquelette d’actine à l’état basal dans les MEF ko Alix. De plus, des marquages de l’actine dans les MEF wt et ko Alix après l’internalisation de la CTxB ne m’ont pas permis de mettre en évidence une distribution aberrante de l’actine en absence d’Alix. Afin de confirmer que l’effet de la déplétion d’Alix sur la CIE n’est pas dû à une perturbation du cytosquelette, il serait intéressant d’analyser l’effet d’un inhibiteur de la polymérisation de l’actine (latrunculine) sur l’internalisation de la CTxB dans les MEF ko Alix.