Comme attendu, la transformation de la bactérie D. radiodurans par de l’ADN génomique qui nécessite l’intégration de l’ADN internalisé dans le génome de la bactérie réceptrice est un mécanisme presque totalement dépendant de la protéine RecA (Figure 65) (diminution de l’efficacité de transformation d’un facteur 233 en absence de RecA). On remarque toutefois que la recombinaison chromosomique n’est pas totalement abolie dans un mutant ∆recA avec une fréquence de bactéries [RifR] de 5,6.10-7 restant supérieure à la fréquence de mutagénèse
spontannée [RifR] (6.10-8 bactéries/mL).
Les niveaux d’implication de RecA dans la transformation sont différents selon les espèces et selon le type d’ADN introduit par transformation. En effet, chez B. subtilis, l’absence de RecA abolit totalement l’intégration de l’ADN génomique dans la cellule hôte mais n’affecte quasiment pas la transformation plasmidique (Kidane et al., 2009). En revanche, chez S.pneumoniae, la protéine RecA est essentielle dans ces deux processus (Martin et al., 1995). Chez D. radiodurans, la protéine RecA n’est pas ou peu impliquée dans la transformation par de l’ADN plasmidique et la transformation par de l’ADN génomique est réduite d’un facteur 233 montrant un nombre non négligeable de transformants dans une souche réceptrice dépourvue de RecA. Il existe donc chez D. radiodurans d’autres protéines ou mécanismes qui contribuent à l’intégration chromosomique d’ADN exogène dans une souche dépourvue de RecA. La protéine RadA, homologue de RecA est exprimée chez D.
radiodurans et il a été proposé qu’elle participe dans l’invasion de brin lors du mécanisme ESDSA
nécessaire à la réparation du génome après irradiation. Elle pourrait donc être un candidat dans ces événements de transformation par de l’ADN génomique RecA-indépendants. De plus, RadA est impliquée dans la transformation par de l’ADN génomique chez d’autres espèces. Elle est induite lors de la compétence chez S. pneumoniae et son absence réduit la transformation d’un facteur 100 (Burghout et al., 2007). Chez B. subtilis, elle n’est pas induite mais son absence réduit la transformation d’un facteur 10 à 37 (Carrasco et al., 2002 , Kruger et al., 1997).
Afin de regarder si RadA joue un rôle dans la transformation chez D. radiodurans, nous avons mesuré la fréquence de transformation dans des souches dépourvues de RadA et dans des souches dépourvues de RadA et de RecA. Les résultats montrent que RadA n’est pas impliquée dans la transformation chez D. radiodurans même en absence de RecA (Figure 65).
Comme chez les autres bactéries naturellement compétentes (S. pneumoniae, H. pylori), l’absence de DprA chez D. radiodurans entraine une diminution de plus de 100 fois de l’efficacité de transformation par de l’ADN génomique. Alors que le laboratoire a montré le rôle majeur de RecFOR dans l’initiation de la réparation des cassures double brin de l’ADN par ESDSA et a proposé que RecFOR soit nécessaire au chargement de la protéine RecA sur l’ADN simple brin, je montre ici que l’absence des protéines RecF et RecO diminue modestement d’un facteur 2 et 3,5 l’efficacité de transformation par de l’ADN génomique suggérant qu’une ou d’autres protéines sont capables de favoriser le chargement de RecA sur l’ADN simple-brin internalisé (Figure 65). Nous suggérons que DprA intervienne chez D. radiodurans comme chez S. pneumoniae dans le chargement de RecA sur l’ADN simple brin internalisé au cours de la transformation par de l’ADN génomique. Il est à noter que dans un contexte mutant ∆dprA, la trasformation par de l’ADN génomique n’est pas totalement
abolie et que des évènements d’intégration de l’ADN génomique dans le chromosome indépendants de DprA sont encore observés. La voie RecFOR pourrait être impliquée dans ces évènements résiduels.
Afin de tester cette hypothèse, l’efficacité de transformation par de l’ADN génomique a été mesurée dans des doubles mutants ∆dprA ∆recF et ∆dprA ∆recO. Chez le premier, une faible
aggravation (réduction d’un facteur 2) du phénotype d’un mutant ∆dprA est observée alors que dans
un mutant ∆dprA ∆recO, la transformation par de l’ADN génomique est totalement abolie, la
fréquence de bactéries [RifR] mesurée après transformation dans un double mutant ∆dprA ∆recO
étant du même ordre de grandeur que la fréquence de mutants [RifR] présents de façon spontanée
dans une culture (de l’ordre de 6.10-8) (Mennecier et al., 2006) et témoin sans ADN dans nos
expériences de transformation) (Figure 65). Nos résultats montrent que parmi les évènements ayant lieu en absence de DprA, une petite proportion semble impliquer la voie RecFOR mais c’est principalement RecO indépendamment de RecF qui semble intervenir dans un mécanisme de secours. Il a déjà été proposé que RecOR puisse seul charger RecA sur les extrémités d’ADN simple brin générées par RecQ et RecJ ((Handa et al., 2009); voir Figure 16). Il est probable que lors de l’internalisation d’ADNsb en absence de DprA, le complexe RecOR soit suffisant au chargement de RecA sur l’ADNsb internalisé indépendemment de RecF. Il faudrait pour cela étudier la fréquence de transformation dans un double mutant ∆dprA∆recR.
Une autre protéine, la protéine DdrB, spécifique des Deinococcaceae, est connue chez D.
radiodurans pour avoir une activité de type SSA en plus de son activité SSB-like (Xu et al., 2010). Il a
été montré précédemment (Bouthier de la Tour et al., 2011) et confirmé ici que, en présence de DprA, l’absence de DdrB n’a aucune influence sur l’efficacité de transformation par de l’ADN génomique. Pourtant, de façon très intéressante, j’ai pu montrer ici qu’en absence de DprA, la
protéine DdrB joue un rôle majeur dans la transformation par de l’ADN génomique (fréquence des bactéries [RifR] mesurée après transformation réduite au même niveau que la fréquence de mutants
spontanés [RifR] dans une culture) (Figure 65). Ceci suggère que DdrB pourrait jouer, du fait de ses
propriétés SSB-like un rôle majeur en absence de DprA dans la protection de l’ADNsb internalisé au cours de la transformation. Sa présence serait par contre une barrière pour le chargement de RecA. En absence de DprA, RecO est requise pour maintenir une fréquence résiduelle de transformation. Nous proposons que l’ADN internalisé couvert par DdrB soit pris en charge par RecO pour déplacer DdrB et faciliter le chargement de RecA.
Figure 65 : Fréquence de transformation par de l’ADN génomique chez différentes souches mutantes de D.
radiodurans.
Des cellules en phase exponentielle de croissance sont transformées comme indiqué dans le matériel et méthodes par 200 ng d’ADN génomique extrait d’une souche résistante à la rifampicyne. (a) La fréquence spontannée de bactéries [RifR] est de 6.10-8 bactéries/mL.