Comme attendu et déjà montré au laboratoire (Bouthier de la Tour et al., 2011), on observe, que l’efficacité de transformation par de l’ADN plasmidique est peu affectée (diminution d’un facteur 3 ou 4) si la souche réceptrice est dépourvue de la protéine RecA (Figure 66). Lors de la transformation par de l’ADN plasmidique, l’établissement du plasmide à partir des fragments d’ADNsb internalisé nécessite la reconstitution d’un ADN circulaire via l’appariement de régions simple brin complémentaires et le comblement des brêches simple brin par une ADN polymérase donc l’intervention de protéines ayant une activité SSA comme RecO ou DdrB. Il s’avère que chez
D.radiodurans, c’est probablement la protéine DdrB, qui est majoritairement impliquée dans cette
étape puisque la fréquence de transformation est diminuée de 65 fois dans un mutant ∆ddrB contre
seulement 7 fois dans un mutant ∆recO (Bouthier de la Tour et al., 2011) et ce travail, Figure 66).
DprA semble moins impliquée dans la transformation par de l’ADN plasmidique que dans la transformation par de l’ADN génomique avec une diminution de la fréquence de transformation par de l’ADN plasmidique de 15 fois en absence de DprA. Par contre, le défaut de transformation s’aggrave avec une diminution supplémentaire de la fréquence de transformation de 7 et 15 fois si l’absence de DprA est respectivement associée à une absence de RecO ou de RecF. Il est intéressant de noter que la transformation par de l’ADN plasmidique n’est pas totalement inhibée en absence de DprA ou en absence de DdrB, mais, de façon très intéressante, j’ai pu montrer ici qu’en absence de DprA, la protéine DdrB joue un rôle essentiel dans la transformation par de l’ADN plasmidique, la fréquence de bactéries [SpcR] obtenues suite à la transformation par le plasmide
pGY11559 conférant la résistance à la spectinomycine étant du même ordre de grandeur (9. 10-8
bactéries/mL) que la fréquence de mutants spontanés [SpcR] dans une culture. Ces résultats sont
cohérents avec l’inhibition chez des bactéries dépourvues de DdrB et DprA de la transformation par de l’ADN génomique décrite ci-dessus. Ceci suggère que DdrB pourrait jouer, du fait de ses propriétés SSB-like un rôle majeur en absence de DprA dans la protection de l’ADNsb internalisé, que celui-ci soit d’origine plasmidique ou génomique.
DdrB serait donc, en absence de DprA, impliqué à deux niveaux dans la transformation par de l’ADN plasmidique (1) protection de l’ADNsb contre la dégradation du fait de ses propriétés SSB-like (2) établissement du plasmide grâce à son activité SSA.
Figure 66 : Fréquence de transformation par de l’ADN plasmidique chez différentes souches mutantes de D.
radiodurans.
Des cellules en phase exponentielle de croissance sont transformées comme indiqué dans le matériel et méthodes par 200 ng d’ADN plasmidique conférant la résistance à la spectinomycine. (b) La fréquence spontannées de bactéries [SpcR] est de 9.10-8 bactéries/mL.
L’implication de DprA dans les mécanismes de transformation varie selon les espèces et le type d’ADN utilisé pour la transformation. Le phénotype conféré par l’absence de dprA entraîne une disparition totale de transformation chez S. pneumoniae (Berge et al., 2003) une diminution de 90 à 95 % de la transformation chromosomique ou plasmidique chez B. subtilis et H. pylori (Yadav et al., 2012, Smeets et al., 2000) et une diminution de 10 000 fois de la transformation par de l’ADN génomique uniquement chez H. influenzae (Karudapuram et al., 1995). Chez D. radiodurans, DprA est principalement impliquée dans la transformation par de l’ADN génomique. Celle-ci est diminuée d’un facteur 133 en absence de dprA mais n’est pas totalement abolie. Ce phénotype très différent de ceux observés chez les espèces citées ce-dessus montre que chez D.radiodurans, d’autres voies/protéines permettent la protection de l’ADN internalisé et son intégration d’ADN dans le chromosome lors de la transformation. Quant à son implication dans la transformation par de l’ADN plasmidique, le phénotype est aussi très différent de ceux déjà observés chez d’autres espèces. L’implication n’est pas nulle chez D. radiodurans ontrairement à chez H. influenzae puisque la transformation est diminuée de 15 fois en absence de DprA mais est loin d’être d’une importance primordiale comme chez S. pneumoniae, B. subtilis ou encore H. pylori. Ces phénotypes très variés chez toutes ces espèces sont probablement le reflet de l’existence et de l’efficacité d’autres protéines capables de suppléer à l’absence de DprA selon l’espèce.
Ici nous avons montré que DdrB semble avoir un rôle important dans la protection de l’ADNsb internalisé dans la cellule, qu’il soit d’origine génomique ou plasmidique et notamment an absence de DprA. A la différence de S. pneumoniae chez qu’il y a deux protéines SSB, SsbA et SsbB, la deuxième étant induite lors de la compétence, il n’y a qu’une seule protéine de type SSB, chez D.
radiodurans, qui est essentielle. On peut donc se demander si chez D. radiodurans, SSB protège
l’ADNsb internalisé lors de la transformation pour former le complexe d’éclipse et si DprA déplace SSB pour protéger l’ADNsb et charger RecA. En absence de DprA, DdrB pourrait participer à la protection de l’ADNsb comme SSB ce qui nécessiterait l’intervention de RecO pour déplacer l’une ou l’autre de ces protéines pour permettre ensuite le chargement de RecA. Il serait intéressant de comparer le taux de dégradation de l’ADNsb internalisé chromosomique et plasmidique dans des souches sauvages, et dépourvues de DprA ou de DdrB ou des deux en même temps.
2. Rôle des domaines N terminal et C terminal de la protéine
DrDprA dans
la transformation chez D. radiodurans.
Si la présence d’un homologue DprA/Smf est commune à D. radiodurans, S. pneumoniae et H. pylori, la structure de cette protéine est bien différente chez ces trois espèces. DrDprA possèdent deux
extra-domaines, en position N-ter et C-ter, en plus du domaine central très conservé de type Rossman Fold, tandis qu’un seul de ces domaines est présent pour SpDprA et HpDprA (Figures 57 et
58). De manière générale, c’est la structure à 3 domaines qui est la plus retrouvée. Pour le moment, seuls les domaines N-ter et central de S. pneumoniae ont pu être associés à une fonction, rôle dans la fermeture de la compétence pour le premier (Mirouze et al., 2013), interaction DprA-DprA et DprA- RecA pour le second (Quevillon-Cheruel et al., 2012, Lisboa et al., 2014). L’étude par RMN du domaine C-ter de HpDprA par nos collaborateurs, J. Lisboa et S.Cheruel (travail non publié, (Lisboa,
2013)), révèle une structure de type Helice-Tour-Helice, généralement impliquée dans l’interaction avec de l’ADN. Cependant, ils n’ont pas pu mettre en évidence cette interaction in vitro.
Nous nous sommes interrogés sur les rôles de ces domaines N-ter et C-ter chez D. radiodurans en étudiant la transformation dans des souches exprimant des versions tronquées de DrDprA
dépourvues du domaine N-terminal (acides aminés 2 à 82) ou du domaine C-terminal (acides aminés 307 à 370) (voir matériel et méthodes). Nous avons aussi étudié si la protéine DprA de S. pneumoniae pouvait complémenter une souche de D.radiodurans dépourvue de DprA.