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B. Les rôles de DprA lors de la transformation

4. Deinococcus radiodurans, une bactérie naturellement compétente

La compétence naturelle de D. radiodurans a été mise en évidence par Moseley et ses collègues entre les années 60 et 80 (Moseley & Setlow, 1968, Tirgari & Moseley, 1980) ce qui a permis par la suite de développer de nombreux outils génétiques faisant de cet organisme une espèce facilement manipulable en laboratoire. Cependant, la transformation en tant que telle et les mécanismes impliqués dans ce processus chez D. radiodurans ont été peu étudiés.

Récemment, des résultats obtenus au laboratoire ont mis en évidence un rôle de DdrB dans la transformation plasmidique (Bouthier de la Tour et al., 2011).

Les cellules dépourvues de DdrB ont une efficacité réduite d’un facteur 100 pour la transformation par de l’ADN plasmidique, un processus qui nécessite probablement pour l’établissement du plasmide dans la cellule, comme chez B. subtilis et S. pneumoniae (Saunders & Guild, 1981, Kidane et

al., 2009), l’appariement des fragments d’ADNsb internalisés, pour reconstituer un ADN double brin

circulaire après comblement des discontinuités simple brin (Figure 55) (Bouthier de la Tour et al., 2011). Alors que chez B. subtilis et S. pneumoniae, c’est la protéine RecO qui, par son activité dans l’appariement simple brin, joue un rôle majeur dans l’établissement des plasmides, chez D.

radiodurans, c’est la protéine DdrB qui assume majoritairement cette fonction, l’efficacité de

transformation par de l’ADN plasmidique ne diminuant que d’un facteur 6 dans des cellules dépourvues de la protéine RecO (Bouthier de la Tour et al., 2011).

Le mécanisme impliqué dans l’établissement dans la cellule d’ADN génomique internalisé fait appel à l’activité recombinase de la protéine RecA. L’absence de RecA entraine une diminution importante de l’efficacité de transformation par de l’ADN génomique chez D. radiodurans (Bouthier de la Tour et

al., 2011). Par contre, l’absence de RecO ou de RecR a un effet beaucoup plus marginal sur la

transformation par de l’ADN génomique, la réduction de l’efficacité de transformation se limitant respectivement à un facteur environ 3 (Bouthier de la Tour et al., 2011). Ceci pose donc la question du chargement de RecA sur l’ADNsb internalisé et du rôle que pourrait jouer la protéine DprA à cette étape.

Problématique

II.

La protéine DprA joue un rôle central dans la transformation chez B. subtilis et S. pneumoniae, à la fois pour protéger l’ADN simple-brin internalisé et pour faciliter le chargement de la protéine RecA sur cet ADN simple-brin couvert de SSB. Un homologue du gène dprA (DR_0120) est présent dans le génome de D. radiodurans. Je me suis donc intéressée à l’implication de la protéine DprA dans la transformation naturelle de D. radiodurans par de l’ADN chromosomique et plasmidique. J’ai également voulu déterminer si d’autres protéines comme DdrB, ou le complexe RecFOR pouvaient jouer un rôle de substitution en son absence. Comme DdrB semble être la protéine majoritairement impliquée dans la transformation plasmidique chez D. radiodurans mais qu’en son absence, la transformation n’est pas totalement abolie, j’ai également posé la question du rôle des protéines DprA, RecO, RecF dans ces évènements résiduels.

Pour cela, les fréquences de transformation par de l’ADN génomique provenant d’une souche de D.

radiodurans résistante à la rifampicyne ou par un plasmide conférant la résistance à la

spectinomycine sont mesurées dans différents contextes mutants.

Parmi les homologues de DprA présents chez les bactéries naturellement transformables, il existe trois types d’organisation : un domaine constitue le cœur de la protéine, puis selon l’espèce, des domaines Nter et Cter peuvent être présents individuellement ou ensemble. Pourquoi une telle variation structurale à travers les espèces, pour des homologues dont le rôle premier est le même : prise en charge de l’ADN internalisé, lever de la barrière SSB, recrutement de RecA ? Chez D.

radiodurans, les trois domaines sont présents, nous nous sommes donc interrogés sur les rôles de

ces domaines N-terminal et C-terminal et nous nous sommes demandé si la présence de ces domaines était strictement requise pour la fonctionnalité de la protéine. Pour cela, des souches portant des délétions dans le gène dprA exprimant des versions tronquées de DrDprA (une protéine

DprA dépourvue de sa région N-terminale (acides aminés 2 à 82) et une autre sans la région C- terminale (acides aminés 307 à 369) ont été construites par remplacement allélique au locus du gène sauvage par la version tronquée. Les souches obtenues ont ensuite été testées pour leur efficacité de transformation.

D’autres questions se posent quant à la diversité structurale des différents homologues de DprA. Si ces protéines ont un même rôle dans les différentes espèces naturellement transformables, la question de leur interchangeabilité se pose, en particulier si elles n’ont pas la même organisation structurale que la protéine DrDprA. Pour cela, les gènes homologues de S. pneumoniae et H. pylori, SpdprA et HpdprA étiquetés ou non et le gène DrdprA ont été clonés dans un vecteur d’expression sous

le contrôle d’un promoteur Pspac. L’objectif est d’introduire ces plasmides exprimant les protéines DprA hétérologues dans une souche de D. radiodurans puis de déléter le gène DrdprA

chromosomique afin d’effectuer des tests de transformation et de déterminer si l’expression des protéines DrDprA, SpDprA ou HpDprA complémente le défaut dans la transformation de bactéries D. radiodurans portant une délétion du gène dprA.

Nous testerons également l’effet d’une mutation dprA dans la radiorésistance en établissant la courbe de survie de bactéries dépourvues de DprA après exposition à des doses croissantes de rayons γ.

L’ensemble de ces travaux devrait nous permettre de mieux définir les rôles respectifs des protéines DprA, RecA, RecO et DdrB dans la transformation chez la bactérie D. radiodurans.

Résultats et discussion

III.

1. Etude du rôle de la protéine DprA dans la transformation chez

D. radiodurans.