Résumé de l’article

Par des expériences en chambre de Ussing sur des cellules cultivées sur inserts nous avons regardé l’effet de l’inhibition des PLC (inhibition pharmacologique ou interférence par ARN) en mesurant deux paramètres : i) le ΔIsc CFTRinh-172 vingt minutes après l’activation du CFTR par de la forskoline (pour les cellules qui expriment la protéine CFTR-WT) ou par de la forskoline + du VX 770, un activateur du canal CFTR-F508del (pour les cellules qui expriment la protéine CFTR-F508del), et qui représente la portion de courant activée dépendante du canal CFTR (Figure 26 A) et ii) le ratio ΔIsc CFTRinh-172/ΔIsc forskoline ± VX 770 qui rend compte du courant CFTR-dépendant encore activé au bout de 20 minutes par rapport à l’activation initiale et qui témoigne finalement de la perte du courant en fonction du temps (Figure 26 B).

Nous avons, dans un premier temps, regardé l’effet de l’inhibition pharmacologique des PLC par l’inhibiteur U73122 ou son analogue inactif U73343 en comparant entre les deux conditions le ΔIsc CFTRinh-172 vingt minutes après l’activation du canal CFTR. Nous avons observé que l’inhibition des PLC diminue le courant CFTR-dépendant dans les cellules qui expriment la protéine CFTR-WT de manière endogène (16HBE14o-) mais également dans les cellules CFBE41o- qui sur-expriment la protéine CFTR-WT (CFBE-WT) ou qui sur-expriment la protéine CFTR-F508del corrigée par la température (CFBE-F508del). Suite à ces expériences nous avons estimé que les PLC participent à hauteur de 33 % dans le courant CFTR-dépendant activé par la forskoline ± VX 770. Nous avons ensuite voulu savoir quelles étaient les isoformes de PLC qui rentrent en jeux dans le courant CFTR-dépendant.

Nous nous sommes focalisés sur 3 isoformes de PLC qui sont décrites comme étant exprimées dans les cellules pulmonaires : la PLCδ1, la PLCγ1 et la PLCβ3 (Bale et al., 2018; Bezzerri et al., 2011; Rimessi et al., 2018; Vachel et al., 2015; Xu et al., 2013). Après avoir vérifié par western blot que ces trois isoformes étaient exprimées dans nos lignées épithéliales bronchiques, nous avons transfecté des siRNA dirigés contre ces trois protéines dans la lignées 16HBE14o-. Par rapport aux cellules transfectées avec le siRNA contrôle, nous n’avons pas observé de différence significative du courant CFTR-dépendant avec le siRNA PLCδ1 (ΔIsc CFTRinh-172 = 10,6 ± 1,9 µA/cm2 pour la condition siRNA contrôle versus 9,1 ± 1,7 µA/cm2 pour la condition siRNA PLCδ1). Nous avons observé, en revanche, une diminution significative du courant CFTR-dépendant avec le siRNA PLCγ1 (ΔIsc CFTRinh-172 = 10,3 ± 1,8 µA/cm2 pour la condition siRNA contrôle versus 6,0 ± 1,6 µA/cm2 pour la condition siRNA PLCγ1) et avec le siRNA PLCβ3 (ΔIsc CFTRinh-172 = 7,1 ± 1,1 µA/cm2 pour la condition siRNA contrôle versus 2,4 ± 0,3 µA/cm2 pour la condition siRNA PLCβ3). La PLCγ1 et la PLCβ3 participent donc au courant CFTR-dépendant dans les cellules qui expriment la protéine CFTR-WT de manière endogène. Pour la suite du projet nous nous commes concentrés sur la PLCβ3 et nous avons regardé son rôle dans le courant CFTR-F508del corrigé par la température dans les cellules CFBE-F508del et dans le courant CFTR-WT dans les cellules contrôles CFBE-WT. Nous avons observé que la PLCβ3 participe également, à hauteur de 25 %, à la fois dans le courant CFTR-F508del corrigé et dans le courant CFTR-WT. Nous avons ensuite comparé par western blot l’expression totale de la protéine CFTR dans les lignées CFTR-F508del et CFBE-WT transfectées avec le siRNA PLCβ3 ou le siRNA contrôle pour trouver une explication à la diminution du courant CFTR-dépendant observée dans les cellules transfectées avec le siRNA PLCβ3. Curieusement nous avons observé une diminution significative de l’expression de la protéine CFTR dans la lignée CFBE-WT mais cette diminution n’a en retour pas été observée dans les cellules CFBE-F508del. Il est possible que la diminution d’expression de CFTR observée dans les CFBE-WT en présence du siRNA PLCβ3 joue un rôle dans la diminution du courant CFTR-dépendant mais elle ne peut néanmoins expliquer à elle seule cette diminution puisqu’elle concerne pareillement les deux lignées : CFBE-F508del et CFBE-WT. Il faut noter que les western blots CFTR ont été réalisés à partir de lysats totaux et ne témoignent pas de l’expression du canal CFTR à la membrane.

Nous avons ensuite regardé si la diminution de courant observée avec l’inhibition pharmacologique des PLC et celle observée avec la transfection du siRNA PLCβ3 étaient reliées. Pour cela nous avons utilisé l’inhibiteur pharmacologique sur des cellules CFBE-F508del et CFBE-WT transfectées avec le siRNA PLCβ3. Nous avons remarqué que l’inhibiteur pharmacologique U73122 diminue de manière équivalente le courant CFTR-dépendant dans les siRNA PLCβ3 et les siRNA contrôle, ceci dans les deux lignées. Ce résultat semble indiquer que d’autres PLC que l’isoforme PLCβ3 participent au courant CFTR-dépendant. En effet, nous avions observé, dans la lignée 16HBE14o-, que la PLCγ1 joue aussi un

rôle dans le courant CFTR-dépendant. Cependant la comparaison des ratios ΔIsc CFTRinh-172/ΔIsc forskoline ± VX 770 entre l’utilisation de l’inhibiteur pharmacologique des PLC ou la condition siRNA PLCβ3 a révélé que l’inhibiteur des PLC induit une chute du courant CFTR-dépendant qui n’est pas observée pour la transfection avec le siRNA PLCβ3. Ce résultat révèle donc des différences entre, d’un côté, l’effet induit par l’inhibiteur pharmacologique et, de l’autre, celui provoqué par la diminution d’expression de la PLCβ3 par la technique de siRNA.

Le courant CFTR-dépendant enregistré en chambre de Ussing grâce à l’application d’un gradient chlorure est un courant global qui comprend, bien sur, l’activité du canal CFTR, mais également celle d’autres canaux qui participent à la sortie des ions chlorure et qui peuvent être exprimés du côté apical ou basolatéral du pseudo-épithélium. Pour expliquer la chute du courant CFTR-dépendant dans le temps en présence de l’inhibiteur U73122, nous avons cherché à identifier la cible de cet agent pharmacologique. Ainsi les mêmes expériences (inhibition des PLC puis activation du canal CFTR) ont été à nouveau réalisées, mais cette fois en inhibant au préalable les canaux chlorures, autres que CFTR, exprimés soit en apical, soit en basolatéral par le DIDS (4’4’-Diisothiocyanatostilbene-2,2’- disulfonic acid) dans les lignées CFBE-F508del corrigée et CFBE-WT. Nous avons observé que la chute du courant due à la présence de l’inhibiteur des PLC était toujours observée lorsque le DIDS était disposé du côté basolatéral de la chambre de Ussing mais qu’elle n’était plus observée lorsque le DIDS était disposé du côté apical de la chambre de Ussing. Nous en concluons que les PLC participent au courant chlorure CFTR-dépendant en stimulant d’autres canaux chlorures exprimés du côté apical des cellules épithéliales bronchiques. Dans le but de savoir si ces canaux étaient activés de manière dépendante du Ca2+, nous avons réalisé les mêmes expériences (inhibition des PLC puis activation du canal CFTR) en incubant au préalable les cellules avec le chélateur calcique intracellulaire BAPTA-AM. Il se trouve que même en présence du BAPTA-AM nous avons observé une chute du courant CFTR-dépendant en présence de l’inhibiteur U73122. Nous en concluons que les PLC exercent une action sur des canaux chlorures autres que CFTR et qui ne sont pas sous la dépendance du Ca2+ intracellulaire.

Pour finir nous avons regardé l’influence des PLC sur les canaux chlorure activés par le Ca2+ (CaCC) via une stimulation par l’UTP. Dans les deux lignées, CFBE-F508del corrigée et CFBE-WT, nous avons observé le même effet, à savoir que la stimulation des canaux CaCC par l’UTP est diminuée en présence de l’inhibiteur pharmacologique des PLC, mais également lorsque les cellules sont transfectées avec le siRNA PLCβ3.

En résumé nous avons mis en évidence un rôle des phospholipases C dans le courant chlorure CFTR-dépendant et également dans le courant chlorure activé par le Ca2+, dans les cellules épithéliales bronchiques CFBE-WT mais aussi CFBE-F508del corrigées.