Il existe dans la littérature des preuves de l’existence d’une intervention des phospholipases C dans la sécrétion chlorure en chambre de Ussing. Dans cette dernière partie nous aborderons les études qui vont dans le sens d’une activation de la sécrétion chlorure par les phospholipases C dans plusieurs modèles cellulaires qui expriment le canal CFTR.
Le peroxyde d’hydrogène stimule la sécrétion chlorure dépendante de CFTR via sa fixation au niveau des récepteurs EP4 couplés aux protéine Gαs (Conner et al., 2013) et il a été observé que la sécrétion chlorure dépendante de CFTR activée par l’H2O2 dans les cellules épithéliales bronchiques humaines diminue de 80 % en présence de l’inhibiteur pharmacologique des PLC : le composé U73122 (Ivonnet et al., 2015). Cette sécrétion chlorure est également dépendante i) du calcium intracellulaire puisque le chélateur calcique BAPTA-AM ainsi que l’inhibiteur des récepteurs à l’IP3, le 2-APB, diminuent respectivement de 75 % et 80 % la réponse au peroxyde d’hydrogène et ii) de la protéine Epac. Les acides désoxycholiques et chénodésoxycholiques stimulent également la sécrétion chlorure dépendante de CFTR en augmentant la concentration d’AMPc intracellulaire (Ao et al., 2013) et il a également été mis en évidence que la sécrétion chlorure par ces deux acides biliaires diminue de 60 %
Figure 20 : Cycle des phosphoinositides
PIP2 : phosphatidylinositol 4,5- biphosphate, PLC : phospholipases C, DAG : diacylglycérol, PA : acide phosphatidique, DGKε : diacylglycérol kinase-ε, CDP-DAG : cytidine diphosphate-diacylglycérol, CDP-DAG synthase : cytidine diphosphate-diacylglycérol synthase, PI synthase : phosphatidylinositol synthase, PI : phosphatidylinositol, PI4K : phosphatidylinositol 4-kinase, PI4P : phosphatidylinositol-4-phosphate, PI4P5K : phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase, ATP : adénosine triphosphate, ADP : adénosine diphosphate, CTP :
le courant chlorure CFTR-dépendant lorsque les PLC sont inhibées dans les cellules épithéliales coloniques T84 (Domingue et al., 2016). La même équipe a par ailleurs montré que la stimulation par les acides biliaires est également réduite par le BAPTA-AM ainsi que par l’inhibition de la protéine Epac et le 2-APB mais elle n’est cependant pas affectée par l’inhibition des PKC. Ces résultats suggèrent l’implication du Ca2+ intracellulaire dans l’activation de la sécrétion chlorure par les PLC au cours d’une stimulation par les acides biliaires. Une autre équipe a montré que la sécrétion chlorure, induite cette fois-ci par une stimulation forskoline, dans ces mêmes cellules intestinales diminue de 40 % en présence de l’inhibiteur de PLC (Hoque et al., 2010). Il s’est avéré que cette sécrétion chlorure stimulée par la forskoline est par ailleurs également dépendante du Ca2+ intracellulaire et des PKC.
Dans des cellules épithéliales intestinales canines (SCBN), il a été montré que la sécrétion chlorure qui suit une activation des récepteurs PAR2 (en anglais « protease-activated receptor 2 ») est diminuée de 60 % en présence de l’inhibiteur des PLC (van der Merwe et al., 2009). Par ailleurs les auteurs ont montré que cette sécrétion chlorure, qui implique les PLC, passe aussi par l’activation des PKCβ1, PKCδ et PKCε.
La sécrétion chlorure dépendante de CFTR qui résulte de la stimulation des récepteurs P2Y par l’UTP dans les cellules épithéliales bronchiques humaines est également diminuée d’environ 60 % en présence de l’inhibiteur des PLC (Namkung et al., 2010). D’autre part, il a été montré que cette sécrétion chlorure activée par l’UTP est dépendante du calcium intracellulaire mais indépendante des PKC.
En résumé, en fonction de la stimulation et du modèle utilisés, la sécrétion chlorure dépendante des PLC passe soit par la voie calcique, soit par l’activation des PKC, soit par l’activation des deux à la fois. A partir de ces exemples publiés dans la littérature nous comprenons maintenant que les PLC, via l’activation des PKC et l’augmentation calcique intracellulaire, ont une action sur la sécrétion chlorure, et à fortiori sur le canal CFTR.
Problématique et objectifs
Notre objectif au cours de ces trois années de thèse était double et nous avons scindé le projet en deux parties. La première a consisté à approfondir le rôle des phospholipases C dans la sécrétion chlorure dépendante de CFTR, tandis que la deuxième partie a reposé sur l’étude de la régulation de l’influx calcique par les phospholipases C. Ces deux parties du projet ont été menées en parallèle dans les cellules épithéliales bronchiques qui expriment la protéine CFTR wild type ou CFTR-F508del.
I. Exploration du rôle des PLC dans la sécrétion chlorure dépendante de CFTR
La protéine CFTR est régulée par de multiples acteurs cellulaires tels que la PKA, les PKC, les adénylates cyclases ou encore le Ca2+, pour n’en citer que quelques-uns. Il s’agit en effet d’une protéine qui est connectée à de nombreux canaux et constituants cellulaires : aujourd’hui il est recensé pas moins de 616 protéines qui établissent des interactions physiques et/ou fonctionnelles avec le canal CFTR (https://www.ebi.ac.uk/intact/). La régulation du canal CFTR est encore activement étudiée dans un souci d’augmenter la spécificité et l’activité de la pharmacologie existante. Notre recherche se place, à ce titre, dans la découverte de nouveaux acteurs cellulaires endogènes qui régulent le canal CFTR. Quelques études ont montré que les phospholipases C contrôlent la sécrétion chlorure dans des cellules qui expriment la protéine CFTR (Conner et al., 2013; Domingue et al., 2016; Hoque et al., 2010; Namkung et al., 2010), cependant aucune isoforme spécifique n’a pour l’instant été mise en cause dans cette régulation.Le premier objectif était de vérifier l’implication des phospholipases C dans la sécrétion chlorure dépendante de CFTR suite à une stimulation forskoline dans les lignées épithéliales bronchiques humaines qui expriment soit le CFTR-WT, soit le CFTR-F508del corrigé par la température. Nous avons ensuite regardé plus concrètement la participation dans la sécrétion chlorure, activée par la forskoline ou l’UTP, de trois isoformes de PLC exprimées dans les cellules épithéliales bronchiques : la PLCδ1, la PLCγ1 et la PLCβ3 (Bezzerri et al., 2011; Vachel et al., 2015; Xu et al., 2013). L’enjeu de cette investigation était de caractériser les isoformes de PLC qui participent à la régulation endogène de la sécrétion dépendante à la fois de la protéine CFTR-WT et de la protéine CFTR-F508del corrigée par la température, dans l’intention d’améliorer la conductance dépendante de CFTR par la voie des phospholipases C dans le contexte de la mucoviscidose.
II. Étude de la régulation de l’influx calcique par les phospholipases C
Les dysfonctionnements ioniques dans la mucoviscidose ne sont pas uniquement le fait du défaut de sécrétion chlorure de CFTR. Même si la mutation du canal constitue l’origine de la maladie, plusieurs
canaux, autres que CFTR, subissent des défauts de régulation en présence de la mutation CFTR-F508del : c’est le cas du canal calcique TRPV6. Ce dernier est régulé par de multiples acteurs, dont la β-glucuronidase Klotho (Lu et al., 2008; Takumida et al., 2009), les protéines annexine 2 et S100A10 (van de Graaf et al., 2003), et la PLCδ1 (Thyagarajan et al., 2008, 2009; Vachel et al., 2015). Parmi les phospholipases C, seule la PLCδ1 a été pour l’instant mise en cause dans la régulation de TRPV6. Dans les cellules épithéliales bronchiques qui expriment la protéine CFTR-WT, il a bien été confirmé que cette phospholipase régule négativement le canal TRPV6 (Vachel et al., 2015). En revanche dans les cellules épithéliales bronchiques qui expriment la protéine CFTR-F508del, cette régulation n’a pas encore été explorée.
Notre deuxième objectif au cours de ce projet de thèse était donc de comprendre la régulation du canal TRPV6 par la PLCδ1 dans les cellules épithéliales bronchiques qui expriment la mutation CFTR-F508del. Par ailleurs le concours de la PLCγ1 et de la PLCβ3 dans la régulation de cet influx dépendant de TRPV6 n’a jamais été exploré : nous l’avons donc étudié dans les cellules épithéliales bronchiques qui expriment soit la protéine CFTR-WT, soit la protéine CFTR-F508del.
Matériel et méthodes
I. Culture cellulaire
Les expériences de ce projet de thèse ont été menées dans des lignées cellulaires bronchiques humaines immortalisées et sélectionnées pour l’étude du CFTR par l’équipe du Professeur Gruenert (Cozens et al., 1994).