Résultats de simulation et pratique de la commande IRFOC

A Tabela 4.6 apresenta os resultados obtidos dos testes anti-bacterianos efectuados com o papel impregnado com nanopartículas de prata. Com as NPsAg para além de se proceder à realização dos testes com as NPsAg sintetizadas e comerciais utilizaram-se, também, materiais de controlo. Tal como explicado no Capítulo 3, os materiais de controlo utilizados foram os dois substratos de papel (Whatman e filtro de café) impregnados com uma suspensão de nitrato de potássio e citrato de sódio e outra suspensão de nitrato de potássio com borohidreto de sódio. Estes materiais de controlo serviram para verificar se o efeito anti-bacteriano das nanopartículas de prata era efectivamente devido às nanopartículas de prata e não devido aos agentes redutores utilizados.

Tabela 4.6 - Actividade anti-bacteriana das NPsAg e dos materiais de controlo: +) ocorreu actividade anti-bacteriana; -) não ocorre actividade anti-bacteriana

Materiais de

controlo negativo Estirpe T = 25ºC Papel Whatman T = 37ºC T = 25ºC Papel de Filtro de café T = 37ºC Nitrato de potássio

via citrato de sódio

E. coli - - - - S.aureus NCTC8325 - - - - S. aureus COL - - - - Nitrato de potássio via borohidreto de sódio E. coli - - - - S.aureus NCTC8325 - - - - S. aureus COL - - - -

NPsAg Estirpe Papel Whatman Papel de Filtro de café

T = 25ºC T = 37ºC T = 25ºC T = 37ºC Via citrato de sódio

(~ 100 nm) E. coli + + + + S.aureus NCTC8325 + + + + S. aureus COL + + + + Via Borohidreto de sódio (~ 20 nm) E. coli - - - - S.aureus NCTC8325 - - - - S. aureus COL - - - - Comerciais (~10 nm) E. coli + + + + S.aureus NCTC8325 + + - - S. aureus COL + + - -

Através da análise da Tabela 4.6 é possível verificar que nos dois materiais de controlo, para qualquer estirpe de bactéria e qualquer temperatura utilizada, não ocorreu nenhum tipo de actividade anti-bacteriana. Assim, pode-se afirmar que a actividade anti-bacteriana apresentada pelos papéis impregnados com as nanopartículas de prata sintetizadas é verdadeiramente devido às nanopartículas de prata e não aos agentes redutores utilizados. Entre os três tipos de nanopartículas de prata utilizados neste estudo, apenas as nanopartículas sintetizadas via citrato de sódio apresentam actividade anti-bacteriana sobre todos os tipos de bactérias em estudo e nas duas temperaturas utilizadas.

Nas nanopartículas de prata comerciais ocorre apenas actividade anti-bacteriana, em ambos os substratos de papel, contra a estirpe E. coli. Na estirpe S. aureus NCTC8325 e S. aureus COL, para qualquer uma das temperaturas, apenas se observa actividade no papel Whatman, o que poderá estar relacionado com o maior grau de impregnação das nanopartículas no papel Whatman em comparação com o papel de filtro de café (Figura 4.15 C1 e C2), onde não se observou nenhum tipo de actividade anti-bacteriana nem mesmo à temperatura não óptima do crescimento das bactérias (T = 25 ºC).

54 As nanopartículas de prata via borohidreto de sódio não apresentaram qualquer tipo de actividade anti-bacteriana contra as estirpes de bactérias. Tal facto pode estar relacionado com a quantidade de nanopartículas existentes em ambos os substratos de papel. Pela Figura 4.15 B1 e B2 observa-se que os papéis apresentam uma baixa impregnação quando comparado com os outros dois tipos de nanopartículas de prata utilizados (Figura 4.15 A1 e A2 e Figura 4.15 C1 e C2) onde se observa uma grande quantidade de nanopartículas depositadas nas fibras de celulose.

Encontra-se reportado na literatura que existem três mecanismos de actuação das nanopartículas de prata contra as bactérias, sendo estes [15, 40, 41]:

1. As nanopartículas de prata, principalmente na gama dos 1 – 10 nm, ligam-se à superfície da membrana celular e perturbam drasticamente as suas funções, tais como a permeabilidade e respiração;

2. As nanopartículas de prata têm a capacidade de penetrar dentro das bactérias causando vários danos pela possibilidade de interacção com compostos constituídos por enxofre e fósforo;

3. As nanopartículas de prata libertam iões de prata, Ag+, que têm uma contribuição adicional para o efeito anti-bacteriano das nanopartículas.

Pelos três mecanismos acima referidos provavelmente poder-se-á relacionar o terceiro mecanismo com o efeito anti-bacteriano observado pelas nanopartículas de prata via citrato de sódio. A libertação de iões de prata promove um efeito anti-bacteriano através da atracção electrostáctica entre as cargas negativas da membrana celular dos micro-organismos e a carga positiva das nanopartículas, promovendo a ligação dos iões Ag+ aos grupos de proteínas funcionais, resultando numa desprotonação proteica. Os iões de Ag+ _{tornam-se, assim,} extremamente tóxicos para as bactérias [79, 80].

No caso das nanopartículas de prata comerciais como o seu tamanho se encontra na faixa dos 1 – 10 nm é mais provável que o efeito observado esteja relacionado ao mecanismo 1, onde as nanopartículas de prata se ligam à superfície da membrana celular e perturbam as funções normais das bactérias. Como o efeito anti-bacteriano destas nanopartículas de prata foi mais eficaz na bactéria E. coli, sendo esta bactéria Gram negativa, ou seja possui uma fina camada de peptidoglicano (~2 – 3 nm) entre a membrana citoplasmática e a membrana exterior, é possível que estas nanopartículas de prata consigam romper essa fina camada e penetrem na bactéria perturbando assim as suas funções vitais [15, 40, 41, 80].

A partir dos resultados obtidos na actividade anti-bacteriana das nanopartículas de prata sintetizadas realizou-se um estudo da influência da concentração da suspensão de nanopartículas de prata na eficácia de impregnação e também na actividade anti-bacteriana, de modo a averiguar qual a concentração mínima necessária a partir do qual ocorre efeito anti- bacteriano.

No estudo da influência da concentração da suspensão das nanopartículas de prata sintetizadas, foram feitas suspensões com diferentes concentrações. Para as nanopartículas de prata via citrato de sódio, foram utilizadas concentrações de 0,1 mM; 0,5 mM e 10 mM. No caso das nanopartículas de prata via borohidreto de sódio, apenas foi aumentada a concentração em dez vezes, de modo a averiguar se com um aumento da concentração ocorria um aumento da impregnação dos substratos de papel e da actividade anti-bacteriana, visto que para uma concentração inferior (1 mM) nenhum destes se observou.

De seguida, apresentam-se as figuras obtidas por SEM dos substratos de papel impregnados com as nanopartículas de prata via citrato de sódio e via borohidreto de sódio com as concentrações acima referidas.

55 Figura 4.22 - Imagens de SEM da impregnação dos substratos de papel impregnados com NPsAg via

citrato de sódio: A) 0,1 mM; B) 0,5 mM; C) 1 mM; D) 10 mM. Numeração: 1) Papel Whatman; 2) papel filtro de café C1 C2 A1 B1 D1 A2 B2 D2 C = 0,1 mM C = 0,1 mM C = 0,5 mM C = 0,5 mM C = 1 mM C = 1 mM C = 10 mM C = 10 mM Nanopartículas

56 Figura 4.23 - Imagens de SEM da impregnação dos substratos de papel com NPsAg via borohidreto de

sódio: A) 1 mM; B) 10 mM. Numeração: 1) Papel Whatman; 2) papel filtro de café

Observando as Figuras 4.22 e 4.23 verifica-se que quanto maior a concentração de nanopartículas de prata mais eficaz se torna a impregnação de ambos os substratos de papel com as nanopartículas.

Na Figura 4.22, quer com o aumento, quer com a redução da concentração da suspensão de nanopartículas de prata, mantém-se a dispersão das nanopartículas ao longo das fibras de celulose não se observando grande quantidade de aglomerados de partículas.

Pela observação das Figuras 4.22 A1 e A2 e Figura 4.22 B1 e B2 verifica-se que ao reduzir a concentração da suspensão de nanopartículas de prata, a impregnação dos substratos de papel Whatman e filtro de café se torna semelhante. Ao comparar as Figuras 4.22 A1 e A2 e Figura 4.22 B1 e B2, com a Figura 4.22 C1 e C2, verifica-se que a quantidade de nanopartículas de prata impregnadas no papel diminui para as menores concentrações. Em contrapartida, assume-se, pela Figura 4.22 D1 e D2, que com o aumento da concentração da suspensão aumenta a quantidade de NPs depositadas em ambos os substratos de papel. Pelo observado, conclui-se que tal como esperado, a concentração da suspensão é um parâmetro que influencia a quantidade de nanopartículas que se consegue depositar nos substratos de papel, sendo que ao diminuir ou aumentar a concentração a quantidade de nanopartículas depositadas também diminui ou aumenta, respectivamente.

Em relação às nanopartículas de prata via borohidreto de sódio verifica-se, comparando as Figuras 4.23 A1 e A2 e Figura 4.23 B1 e B2, uma grande diferença na impregnação dos substratos de papel. Tal como ocorreu com as nanopartículas de prata via citrato de sódio, com o aumento da concentração a impregnação do papel torna-se bastante mais eficaz. Enquanto com uma concentração de 1 mM não se observavam NPsAg no substrato de papel Whatman, com o aumento da concentração para 10 mM observam-se bastantes nanopartículas de prata ao longo das fibras de celulose. O mesmo sucede para o papel de filtro de café, onde com o aumento da concentração se observa um aumento da impregnação deste tipo de papel. Em ambos os papéis as nanopartículas encontram-se bem dispersas nas fibras de celulose, formando alguns aglomerados de pequenas dimensões. Para uma concentração de 10 mM o tamanho das nanopartículas impregnadas varia entre os 10 – 70 nm.

Na Tabela 4.7 apresentam-se os resultados obtidos para a actividade anti-bacteriana com o aumento da concentração das suspensões de nanopartículas de prata sintetizadas.

B1 B2 A1 A2 C = 10 mM C = 10 mM C = 1 mM C = 1 mM Nanopartículas

57 Tabela 4.7 - Actividade anti-bacteriana das NPsAg sintetizadas via citrato de sódio e via borohidreto de sódio variando a concentração: +) ocorreu actividade anti-bacteriana; -) não ocorreu actividade anti- bacteriana

NPsAg Concentração _(mM) Estirpe Papel Whatman Papel de filtro de café

T = 25 ºC T = 37 ºC T = 25 ºC T = 37 ºC Via citrato de sódio 0,1 E. coli + + + + S. aureus NCTC8325 - - - - S. aureus COL - - - - 0,5 E. coli + + + + S. aureus NCTC8325 - - - - S. aureus COL +/- + +/- + 1 E. coli + + + + S. aureus NCTC8325 + + + + S. aureus COL + + + + 10 E. coli + + + + S. aureus NCTC8325 + + + + S. aureus COL + + + + Via borohidreto de sódio 1 E. coli - - - - S. aureus NCTC8325 - - - - S. aureus COL - - - - 10 E. coli +/- - +/- - S. aureus NCTC8325 - - - - S. aureus COL - - - -

Pela análise da Tabela 4.7 verifica-se, no caso das nanopartículas de prata via citrato de sódio, que ao diminuir a concentração da suspensão para 0,1 mM o efeito anti-bacteriano das NPs contra a bactéria S. aureus NCTC8325 e a bactéria S. aureus COL é perdido. Contudo, o efeito contra a bactéria E. coli mantém-se mesmo para a menor concentração testada, 0,1 mM. Para uma concentração de 0,5 mM, apesar da actividade anti-bacteriana manifestada ser fraca, verifica-se novamente um efeito anti-bacteriano das nanopartículas de prata via citrato de sódio contra a bactéria S. aureus COL.

Como era expectável, ao apresentar efeito anti-bacteriano para uma concentração de 1 mM, o mesmo verificou-se ao aumentar a concentração da suspensão para 10 mM, mantendo-se e tornando-se mais intensa a actividade anti-bacteriana exibida contra todas as estirpes de bactérias. A Figura 4.24 apresenta uma comparação dos halos de inibição formados na actividade anti-bacteriana das nanopartículas de prata via citrato de sódio para uma concentração de 1 mM e 10 mM.

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Estirpe C = 1 mM _{T = 25 ºC} C = 10 mM _{T = 25 ºC}

Whatman Filtro de café Whatman Filtro de café

E. coli DH5α

S. aureus NCTC8325

S. aureus COL

T = 37 ºC T = 37 ºC

Whatman Filtro de café Whatman Filtro de café

E. coli DH5α

S. aureus NCTC8325

S. aureus COL

Figura 4.24 - Comparação dos halos de inibição formados usando uma concentração de 1 mM e 10 mM nas NPsAg via citrato de sódio

Nota: Para testar a actividade anti-bacteriana dos papéis impregnados com as nanopartículas, estes foram cortados em quadrados de 1 x 1 cm e colocados no agar de Muller-Hinton. As imagens em cima exibidas foram posteriormente tratadas por forma a melhorar a sua visualização.

Analisando a Figura 4.24 verifica-se que ocorreu um aumento do halo de inibição ao aumentar a concentração da suspensão de nanopartículas de prata via citrato de sódio, obtendo-se assim um efeito anti-bacteriano mais pronunciado.

No caso das nanopartículas de prata via borohidreto de sódio ao aumentar a concentração para 10 mM observou-se um pequeno efeito anti-bacteriano contra a bactéria E.coli em ambos os substratos de papel. Contudo este efeito só se observou a uma T = 25 ºC, temperatura esta não óptima do crescimento das bactérias, logo maior a probabilidade de existência de efeito anti-bacteriano uma vez que as bactérias se encontram em condições adversas ao seu desenvolvimento.

Através deste estudo, verificou-se que com um aumento da concentração obtém-se um aumento da impregnação de ambos os substratos de papel e com esse aumento a actividade anti-bacteriana das nanopartículas de prata também aumenta.

Conclui-se para as nanopartículas de prata via citrato de sódio que a partir de uma concentração de 0,1 mM ocorre actividade anti-bacteriana contra a bactéria E. coli, sendo necessária uma concentração de 1 mM para ocorrência de actividade anti-bacteriana contra as

59 estirpes de S. aureus NCTC8325 e S. aureus COL. Por outro lado, para as nanopartículas de prata via borohidreto de sódio seria necessário aumentar ainda mais a concentração deste tipo de nanopartículas de prata de modo a se conseguir aumentar o fraco efeito anti-bacteriano apresentado.