I–I
DENTIFICATION DES PARTENAIRES PROTÉIQUES DELARP1
Pour rappel, laàth ati ueàdeà e he heàdeàl’ uipeàestà e t eàsu àleà leàdesàRBPàda sà les reprogrammations post-transcriptionnelles en réponse au stress thermique chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. En ce sens, les travaux publiés en 2013 dans Cell Reports (Merret et al., 2013) ont mis en évidence un phénomène massif de dégradation cytoplasmique sur plusieurs illie sà d’áRN à médié par la protéine LARP1 età l’e o i o u l aseà XRN .à La découverte de ce mécanisme a néanmoins soulevé des questions sur les processus de sélection permettant le ciblage spécifique des ARNm à dégrader. Auà uà deà l’i pli atio à deà LáRP à da sà laà po seà auà st ess,àu eà e he heàd’i te a ta tsàdeàcette RBP a été menée par un crible double hybride. Parmi les 15 candidats identifiés par cette approche dont notamment XRN4 et PAB2, deux protéines à domaine YTH ont été reconnues : ECT2 et ECT8. Puisque les travaux sur les protéines à domaine YTHà hezàlesà a if esà o t e tà u’ellesà gulent entre-autre la stabilité des ARNm méthylés, l’h poth seàalo sà iseàse aità ueà esàp ot i esà àdo ai eàYTHàd’Arabidopsis puissent également agir dans la déstabilisation de certains transcrits par une interaction avec LARP1. Ce premier modèle envisagé propose que la méthylation pourrait être un moyen de cibler les transcrits à dégrader en condition de stress chez la plante et que les complexes LARP1-XNR4 seraient dirigés sur ces cibles méthylées par le biais des lecteurs potentiels de méthylation ECT2 ou ECT8. Ces suggestions impliquent néanmoins de démontrer la fonctionnalité de lecteurs de méthylation chez
Arabidopsis, notamment ECT2 et/ou ECT8, tout comme de déterminer l’e iste eàdesài te a tio sà entre LARP1 et ECT2 ou ECT8 dans la plante.
II–I
DENTIFICATION DE PROTÉINES DE LIAISON À LA MÉTHYLATION M6A
E à o s ue e,à lesà p e ie sà t a au à deà aà th seà o tà t à d di sà à l’ide tifi ation de protéines de liaisons aux résidus m6A chez Arabidopsis thaliana.àáu u àdeà esàle teu sà ’avait été identifié ou caractérisé dans un végétal supérieur à cette période. Pour cela, nous avons choisi de mettre en place une approche globale en développant une h o atog aphieà d’affi it à pou à u à ARN méthylé (Figure 18-A). Cette méthode a déjà été utilisée en cellules humaines et chez la levure etàaàpe isàd’ide tifie àdesà le teu sàdeà th latio chez ces espèces (Dominissini et al., 2012; Schwartz et al., 2013). Un t a ailà d’opti isatio à aà t à essai eà pou à e ploite à etteà
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app o heà àpa ti àdeàtissusà g tau ,à eà uiàa aitàfaitàl’o jetàdeà o àstageàdeà aste à à(Scutenaire, 2014). Avec cette approche, l’id eà està deà o pa e à pa à spe t o t ieà deà asseà lesà p ot i esà s’asso ia tàdeà a i eàsp ifi ueàouàa e àu eàplusàfo teàaffi it àpou àu àáRNàs th ti ueà th l à par rapport à un même ARN dans sa version non méthylée (séquence issue de Wang et al., 2014b). Laà thodeàd’ lutio a été réalisée par compétition avec un excès de m6A libre (Dominissini et al., 2013) afi à deà fa o ise à leà d o hageà desà fa teu sà affi sà pou à laà th latio .à L’app o heà aà t à o duiteà e àt ipli atà iologi ueà àpa ti à d’e t aits natifs de protéines de plantes de 3 semaines cultivées en condition normale pour déterminer les lecteurs constitutifs de la méthylation des ARN mais également à partir de plantes incubées 30 min à 38°C afin de déterminer si un stress environnemental modifie qualitativement et/ou quantitativement les facteurs de liaison à la méthylation.
En comparant les résultats obtenus pour les deux types de colonnes (méthylée ou non méthylée), 7 protéines ont été spécifiquement retrouvées dans la colonne méthylée en condition normale (Figure 18-B). Parmi celles-ci, il y a deux protéines, PTB3 et EMB140, qui ont une capacité p diteàdeàliaiso à àl’áRN,àleàfa teu àM“N àli àauà ta olis eàdesàsu es,àu ài hi iteu àdeàpe ti eà méthylestérase nommé PMEI9 mais surtout trois protéines à domaine YTH : ECT2, 3 et 5. En analysant les peptides identifiés, ilà s’a eà ueà seuleà ECT à està p se teà da sà lesà t oisà pli atsà associés avec la cible méthylée. Les autres facteurs sont identifiés dans deux des trois réplicats dont ECT3 et 5, ou un seul réplicat sur les trois. La profondeur réduite deàl’app o heà ’aà epe da tà pasàpe isàd’ ta li àd’a al sesàstatisti ues.àMalgré cela, trois protéines à domaine YTH ont pu être identifiées dont ECT2 dans trois réplicats différents ce qui suggère que les protéines à domaine YTH ont une fonction conservée de liaison aux ARN méthylés.
D’aut eàpa t,àe à o ditio àst ess e,à àp ot i esàso tàsp ifi ue e tàide tifi esàe àliaiso à avec la cible méthylée (Figure 18-C). Parmi celles-ci, seulement un facteur est présent dans les trois réplicats avec la cible méthylée.à Ilà s’agità d’u eà u it à deà laà Ru is o,à u eà p ot i eà t sà abondante chez les végétaux qui peut potentiellement être attribuée à du bruit de fond. Les 24 autres facteurs sont présents dans un ou deux réplicats sur les trois. Au niveau de leur fonction, la ajo it àdesà a didatsàposs deàu eàa ti it àp diteàdeàliaiso à àl’áRNàvia la présence de domaine RRM (RNA-Recognition Motif). Il y a également des constituants structuraux des ribosomes ou encore des facteurs avec une activité prédite de liaison aux ions cuivres et fers. Finalement, deux protéines à domaine YTH, ECT2 et ECT5 sont encore une fois identifiées. En dehors de ces deux p ot i esà àdo ai eàYTH,àau u àaut eàfa teu à ’està o u àe t eàlaà ondition normale et la
situatio àdeàst ess.àCe ià e fo eàl’id eà ueàl’ide tifi atio àd’ECT àetà àestà ie àsp ifi ueàdeàleu à association avec la cible méthylée et rejoint le fait que les protéines à domaine YTH ont une fonction évolutivement conservée de liaison aux ARN méthylés.à M eà sià d’aut esà fa teu sà identifiés en condition normale ou au cours d’u àst essàpou aie tà e pli à esàfo tio sàdeàliaiso à aux résidus m6A, il est apparu évident de se concentrer sur les protéines à domaine YTH puisque ce sont les lecteurs les plus documentés à ce jour chez les eucaryotes.
D’aut eàpa t,à eàsiàl’app o heàde protéomique ’aàpasà t à e eàa e àu àpa a t eà ua titatif,àilàestài t iga tàdeà oi à ueàleà o eàdeàpeptidesàd’ECT àestàt sàsi ilai eàe t eàlesà deux conditions environnementales (7 peptides au total dans les trois réplicats à 20°C contre 8 peptidesà à °C àalo sà ueàleà o eàdeàpeptidesàd’ECT àdi i ueàpa à àda sàlaà o ditio àst ess e.à En considérant les trois réplicats, le nombre de peptides pour ECT2 passe ainsi de 8 en condition o aleà à àe àsituatio àdeàst essàthe i ue.àDa sàlaà eàopti ue,àECT à ’estàpasà et ou eà dans la situation de stress. Bien que cette observation soit très préliminaire, elle pourrait suggérer que le stress puisse influer su àlaà apa it àd’ECT àet/ouàECT à ài te agi àa e àu àáRNà th l .àáuà uà d’u eà telleà h poth se,à ilà està appa uà i dispe sa leà d’e plo e à plusà e à d tails le lien entre le stress thermique et la fonction des lecteurs de méthylation chez Arabidopsis.
III–O
BJECTIFSAu cours desà de i esà a es,à deà ou ellesà oiesà deà gulatio à deà l’e p essio à so tà apparues avec la découverte de modifications pos-transcriptionnelles comme la N6-méthyladenosine pouvant influencer le devenir des ARNm. À l’i ageà deà l’ pig ti ueà su à l’áDN,à eà ou eauà odeà pit a s ipto i ueàestàgou e àpa àl’a tio àdesàle teu sàdi e tsàdeà esà modifications qui apportent un niveau supplémentaire de régulation post-transcriptionnelle. Ainsi, pour comprendre le rôle de la méthylation m6A sur le métabolisme des ARN messagers, il est p i o dialàd’ lu ide àl’a tio àde ces lecteurs et de leurs effets sur lesàt a s itsà th l s.àC’està da sà etteà opti ueà ueà s’i s i e tà esà t a au à deà th seà a e à pou à o je tifà d’ide tifie à età de caractériser les fonctions du premier lecteur de méthylation des ARNm chez Arabidopsis thaliana. áuà uàdesàdo esàe ista tesà hezàl’ho eàetàdesà sultatsàp li i ai esàdeà olo eàd’affi it ,à ot eà hoi às’està apide e tào ie t à e sàl’ tudeàdesàp ot i esàECT,à ’est-à-dire les protéines à do ai eàYTHà hezàlaàpla te.àN a oi s,à eàsiàt oisàd’e t e-elles ont été identifiées avec une cible ARN méthylée en condition normale, il est apparu judicieux de se concentrer plus précisément sur le candidat ECT2. En effet,àlesàp e i esàdo esàpoi te tàsu àleàfaità u’ECT à:à i à
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est un interactant en double hybride de LARP1, une protéine largement impliquée dans le contrôle de la traduction et de la stabilité des ARNm ; (ii) est la protéine candidate retrouvée de façon systématique (3 réplicats) avec un ARN synthétique méthylé en condition normale ; (iii) semble oi sà s’asso ie à à u eà i leà th l eà e à situatio à deà st essà the i ueà pou a t suggérer une modification de sa capacité de liaison à la méthylation. Ces travaux de thèse ont donc été axés autou àdeàplusieu sà uestio sàafi àd’ tudie àplusàp is e tàleà leàdeà etteàp ot i e :
1- La protéine ECT2 est-elle une protéine de liaison aux ARNm méthylés chez Arabidopsis
thaliana ? Quel est son rôle dans le développement ?
Pour répondre à ces questions, une première description globale du facteur ECT2 a été effe tu e.àToutàd’a o d,àdes analyses évolutives de protéines à domaine YTH ont été effectuées pour déterminer si ECT2 possède effectivement la capacité à lier la méthylation des ARNm. Ainsi, des approches in vivo ont été développées pour y étudier son association avec des cibles porteuses de m6A. Puisque la méthylation est essentielle à la survie et au développement des pla tes,àleà leàd’ECT àda sàleàd eloppe e tàa été évalué. Enfin, la localisation subcellulaire de la protéine a été étudiée pour dégager une première piste quant à sa fonction moléculaire. Ces t a au à o e e tàl’e se leàduàChapit eàI.à
2- Quels sont les partenaires protéiques de la protéine ECT2 ?
Pou àte te àdeà po d eà à etteà uestio ,àj’aià alis àu eàapp o heà o à i l eà o sista tà déterminer dans quel(s) complexe(s) la protéine ECT2 s’i t g e. Pour cela, une recherche de partenaires protéiques a été effe tu eà àl’ helleàduàp ot o e.àL’ide tifi atio àdesàpa te ai esàa ainsi permis d’ ett eàdesàh poth sesàsu àlesàfo tio sà ol ulai esàd’ECT .àCetteàapp o heàfe aà l’o jetàduàChapit eàII.à
3- Quelà està leà leà d’ECT à da sà leà o t leà deà laà t adu tio à età deà la stabilité des ARN messagers en lien avec ses partenaires ?
Nous savons que les protéines à domaine YTH humaines sont impliquées dans le contrôle de la traduction et de la stabilité des transcrits méthylés. Ainsi par une approche ciblée, les fonctions moléculaires d’ECT à ont été étudiées plus particulièrement en lien avec la protéine LARP1,à u à pa te ai eà pote tielà d’ECT à i pli u à da sà es voies de régulation post-transcriptionnelles.àL’a al seàp i ipaleàa consisté à esu e àl’i pa tàd’ECT àsu àle translatome à l’aideà d’u eà app o heà deà s ue çageà d’áRN.à Cesà app o hesà se o tà d elopp esà auà ou sà duà Chapitre III.
4- Les conditions environnementales régulent-ellesàlesàfo tio sàd’ECT à?àEt si oui, par quel(s) moyen(s) ? ECT2 joue-t-elle un rôle dans les voies de réponse à un stress thermique ?
Cu ieuse e t,à l’e p ie eà deà olo eà d’affi it à à u eà i leà áRNà th l eà suggère une diff e eà d’asso iatio à d’ECT à e à o ditio à deà st ess.à Ainsi, des travaux ont été menés pour d fi i àsiàlaà apa it àd’ECT à àlie àla m6A pourrait être modifiée avec un stress thermique et pour d ou i à o e tàu eàtelleà gulatio àestàpossi le.àDeàplus,àl’i pli atio àd’ECT àda sàlaà po seà au stress a été mesurée en lien avec leàfaità u’elleài te agitàa e àLáRP , un acteur impliqué dans les mécanismes d’adaptatio à desà pla tesà auà st essà the i ue.à Cesà points seront finalement étudiés dans le Chapitre IV.
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