áp sàa oi àdo u e t àleà leàd’ECT àe à o ditio à o ale,àdans un second temps je me suis intéressé à la fonction et la régulatio à d’ECT à dans la réponse des plantes face au stress thermique. En effet, ilà aà t à o t à u’ECT à i te agità a e à LáRP à e à o ditio à o ale mais également en situation de stress. Sachant que LARP1 est impliquée dans un phénomène massif de dégradation cytoplas i ueà d’áRN à e à st essà the i ue (Merret et al., 2013), j’aià he h à à déterminer si ECT2 pourrait également prendre part à ce mécanisme. Par ailleurs, plusieurs points elatifsà au à hapit esà p de tsà suppo te tà ueà l’a ti it à d’ECT à pourrait être régulée en situation de stress thermique. E àeffet,àlesàdo esàp li i ai esàdeà olo eàd’affi it à àu àáRNà méthylé montrent une plus fai leà ide tifi atio à d’ECT à à °C,à ce qui pourrait supposer une capacité modifiée de liaison à la méthylation. De même, en situation de stress thermique, la lo alisatio à su ellulai eà d’ECT à està odifi eà puis u’elleà s’ag geà da sà lesà g a ulesà deà st ess.à Finalement, avec l’app o heà deà p ot o i ueà ua titati e, j’ai montré que le stress thermique odifieà o sid a le e tà à laà aisseà leà o eà deà pa te ai esà pote tielsà d’ECT .à M eà sià e tai esà i te a tio sà peu e tà t eà di esà pa à laà p se eà d’áRN,à laà du tio à glo aleà deà pa te ai esàsugg eà u’ilà àaà oi sàdeà o ple esài pli ua tàECT à ui sont formés en situation de stress alo sà ueàl’a u ulatio àd’ECT àe à o ditio àdeàst essà ’estàpasà odifi e. Ainsi, dans un p e ie àte ps,àl’i pli atio àd’ECT àda sàlesà oiesàdeà po sesàauàst essàthe i ueàa été étudiée puis des travaux ont été menés afin de déterminer si et comment ECT2 est régulée au cours du stress thermique.
I–Q
UEL EST LE RÔLE D’ECT
DANS LA RÉPONSE AU STRESS THERMIQUE?
Desà t a au à a t ieu sà deà l’ uipeà o tà isà e à ide eà u à ph o eà assifà deà d g adatio à d’áRN à da sà lesà p e i esà po sesà ol ulai esà d’u à st essà the i ue,à faisa tà i te e i à laà p ot i eà LáRP à età l’e o i o u l aseà XRN à (Merret et al., 2013 et 2015). Sachant u’ECT ài te agitàa e àLáRP ,ào àpourrait alors envisager un modèle où ECT2 participerait à ce mécanisme en adressant les complexes LARP1-XRN4 vers les transcrits méthylés à dégrader.
Avant le stress
Figure 33 : Les mutants ect2 ne semblent pas avoir de défaut de thermotolérance
(A) Plantules de 5 jours de génotype Col0, des mutants ect2-1, ect2-2 et de la lignée transgénique YFP-ECT2 #17,
cultivées sur milieu MS (1% Sucrose pour LAT, SAT et BT ou 0,1% sucrose pour TMHT). (B) Phénotype des plantules après 7 jours de récupération suivant quatre régimes de thermotolérance différents. Les détails des différent régimes sont schématisés à gauche de chaque photographie.
Col0 ect2-1 ect2-2 YFP-ECT2 #17 B A 5j 20°C 2h LAT SAT TMHT BT 20°C 5j 37°C 1h 44°C 45min 20°C 7j
Short-term Acquired Thermotolerance
20°C 44°C 23min 20°C 7j Basale Thermotolerance 20°C 2j 20°C 5j 37°C 1h 44°C 45min 20°C 7j
Long-term Acquired Thermotolerance
5j 20°C
35°C 5j
20°C 7j
Thermotolerance to Moderately High Temperature
I.1 – ECT2 ne semble pas requise pour la thermotolérance des plantes
Pou à ifie àtoutàd’a o dàl’i po ta eàph siologi ueàdeàlaàp ot i eàECT àauà ou sàd’u eà exposition à un stress thermique, des tests de thermotolérance ont été réalisés. Quatre régimes différents de thermotolérance (définis selon Liu et al., 2011) ont été choisis pe etta tàd’ tudie à la réponse des plantes :àauà ou sàd’u àst essàdeàfo teài te sit àap sàu eàp e i eàe positio à àu à stress modéré dans une fenêtre de temps courte (SAT : Short-term Acquired Thermotolerance) ou longue (LAT : Long-term Acquired thermotolerance) mais aussi la réponse basale en situation de stress de forte intensité (BT : Basale Thermotolerance) ou encore la réponse après un stress od à d’u eà du eà lo gueà TMHT : Thermotolerance to moderately high temperature). Il a notamment été montré que des plantes mutantes XRN4 survivent beaucoup moins bien que des plantes Col0 dans des régimes de stress thermique comme la TMHT ce qui supporte l’i po ta eà de ce facteur da sàleà a is eàd’acclimatation au stress thermique (Merret et al., 2013). Pour cela, les tests ont été réalisés sur des plantules de 5 jours en comparant des plantes sauvages Col0 aux deux lignées mutantes ect2-1 et ect2-2 ainsi que des plantes complémentées avec la version YFP-ECT2 (Figure 33-A). Après 7 jours de récupération, au u eàdiff e eàflag a teàdeàsu ieà ’aà été observée entre les mutants et Col0 dans les 4 régimes de thermotolérance testés (Figure 33-B). Bien que les e p ie esà ’aie tàpasà t à p t esàa e àu àaspe tà ua titatif,à ette première observation se leà e lu eà l’i pli atio à d’ECT à da sà lesà a is esà deà the otol a e.à N a oi s,à ilà està diffi ileà deà pou oi à o lu eà sa ha tà u’ilà e isteà à p ot i esà ECTà a ec un domaine YTH de type F. Ilà està possi leà u’u eà aut eà p ot i eà ECTà puisseà o pe se à l’a se eà d’ECT à eàpe etta tàpasàdeàfai eàappa aît eàdeàd fautsàph siologi ues.à
I.2 – ECT2 ne semble pas impliquée dans la dégradation des ARNm en
réponse au stress thermique
Pou à s’i t esse à e suiteà à u à aspe tà ol ulai e,à lesà do esà deà t a s ipto i ues établies précédemment ont été exploitées pour la condition stressée afin de déterminer si ECT2 pourrait prendre part à la dégradation des transcrits en situation de stress thermique. Pour cela, l’o je tifàa t àd’ide tifie àlesàt a s itsà i lesàdeàlaàd g adatio àda sàu àCol àdont la quantité à l’ uili eàestàd pe da teàdeàlaàp se eàd’XRN à àl’aide des données du mutant xrn4-5 puis de déterminer leur comportement dans le mutant ect2-2. Dans chacun des cas, la fiabilité des données de transcriptomique de chaque réplicat du mutant xrn4-5 ainsi que les réplicats de Col0 et ect2-2 en situation de stress a été vérifiée en construisant des droites de régression. Les droites
obtenues ont montré une pente et un coefficient de détermination proche de 1 (données non o t es .àCo eàilà àaàpeuàd’ a tàe t eàlesà aleu sàdesà pli ats,àlaà o e eàdesàdeu àaàdonc t àutilis eàpou àl’a al se.àà
L’i pa tàduàst essàthe i ueàsu àl’a u ulatio àdesàt a s itsàaà t à esu àe àcalculant un indice de variation (V) obtenu en divisant le nombre de lectures à 38°C (Q38°C) par celui à 20°C (Q20°C) pour chaque transcrit.àPou àfai eàu àlie àa e àlesàdo esàp de tesàdeàl’ uipe, seuls les transcrits avec une variation inférieure (sous-accumulation) d’u àfa teu à2 ont été considérés, ’est-à-dire présentant un indice V (Q38°C/Q20°C) inférieur à 0,5. Avec ce critère, dans la fraction totale du génotype Col0, le stress provoque la sous-accumulation de 2 066 transcrits. Il faut noter que ce chiffre est bien inférieur au àt a au àp de tsàdeàl’ uipe où environ 4 500 transcrits ont été identifiés comme sous-accumulés (Merret et al., 2013, 2015) car seuls les transcrits avec au minimum 5 rpkm dans au moins une librairie ont été considérés. âà ote à u’en considérant un seuilà lassi ueàd’auà oi sà à pk àda sàauà oi sàu eàli ai ie,à eàso tà 3 440 transcrits qui sont sous-accumulés en condition de stress. Néanmoins, dans cette analyse, le temps de stress (15 min) est différent des analyses précédentes (30 min) ce qui peut expliquer que moins de transcrits sont affectés. Parmi les 2 066 transcrits sous-accumulés avec le stress thermique, plus de 70 %àd’e t e-eux voient leur indice de variation évoluer e t eà , àetà , ,à ’est-à-dire une diminution de 2 à 3 foisà i f ieu eà pa à appo tà à laà o ditio à o ale.à E à s’i téressant aux catégories GO de ces transcrits sous-accumulés, on retrouve dans les premières catégories les gènes associés aux voies de signalisations des protéines réceptrices (GO:0007167, p-value : 1,6.10-18, 44 facteurs/140), à la réponse aux stimuli liés à l’au i eà GO: ,àp-value : 1,8.10-13, 60 facteurs/360) mais aussi à la réponse aux stimuli hormonaux (GO:0009725, p-value : 3,1.10-12, 109 facteurs/982). De nombreuses autres catégories sont associées à la régulation de processus métaboliques, ce qui suggère comme précédemment ueàleàst essàthe i ueàaffe teà ajo itai e e tàl’e p essio àdeà gènes de ménage.
En parallèle, 1 615 transcrits sont sous-accumulées dans xrn4-5 et 2 277 dans ect2-2 (Figure 34-A). Une grande majorité des cibles, 1 095 transcrits pour être exact, est commune entre les trois génotypes illustrant que le stress affecte qualitativement la sous-accumulation des mêmes g oupesàdeàt a s its.àCe iàestàe àa o dàa e àlesàdo esàpu li esàdeàl’ uipeàoù il avait été mis e à a a tà u’XRN à taità i pli u eà da sà u à ontrôle quantitatif des cibles du stress plutôt que qualitatif. Ainsi, 60 % de transcrits sous-accumulés dans la fraction totale de Col0 (1 223 sur 2 066) sont également sous-accumulés dans la fraction totale du fond mutant xrn4-5. Néanmoins, sur un