Les résultats originaux de l’étude

Nos travaux ont permis d’identifier des différences particulières au niveau des profils de MMPs entre des CECs DECF et saines :

• 2.1.1 Dérégulation de MMPs spécifiques

• 2.1.2 Différences dans la proportion de MMPs activées

• 2.1.3 L’influence de la morphologie cellulaire sur le profil des MMPs et TIMPs est différente dans la DECF

• 2.1.4 Identification d’une relocalisation de la MT1-MMP au niveau de spécimens DECF

Ces résultats montrent un déséquilibre au niveau des protéases et inhibiteurs de protéases exprimés par les CECs DECF in vitro, ainsi que des différences au niveau

de l’expression de la MT1-MMP au niveau de spécimen DECF ex vivo. Ces observations pourraient donc expliquer l’accumulation pathologique de MEC sous forme de guttae in vivo.

2.1.1 Dérégulation de MMPs spécifiques

Les tests quantitatifs ont détecté des différences significatives entre les quantités de certaines MMPs sécrétées par les CECs DECF et saines, telles qu’une diminution des MMP-2 et -10, et une augmentation de la MMP-1.

La MMP-2 et la MMP-10 ont été retrouvées à la baisse parmi les CECs DECF.

MMP2 était le 5e _{gène le plus transcrit et était 1,7 fois (p=0,084) plus exprimé chez} les CECs DECF que les CECs saines (toutes morphologies confondues). L’expression protéique de la MMP-2 était cependant moindre chez les populations DECF (4,2-fois, p=0,009), suggérant une régulation post-transcriptionnelle de la MMP-2. Cette dernière est une gélatinase dégradant la gélatine. Elle peut également dégrader la fibronectine, la laminine et différents types de collagène, dont le collagène de type IV [44, 123, 129, 135]. Ces derniers sont tous des composantes importantes des guttae. De plus, contrairement à la plupart des MMPs, la MMP-2 est une protéase exprimée de façon constitutive [170, 171]. Ainsi, la détection d’une baisse dans l’expression de cette MMP devrait être considérée particulièrement anormale. Ces résultats suggèrent donc le rôle potentiel de la MMP-2 dans l’accumulation anormale de MEC retrouvée dans la DECF.

Aucune expression de MMP10 n’a été détectée dans le profilage génique. Les tests quantitatifs ont cependant montré des concentrations élevées de MMP-10. Une explication possible pour cette observation est que des populations différentes de CECs ont été utilisées pour le profilage génique et les tests quantitatifs. Par conséquent, les comparaisons faites entre les expressions géniques et protéiques ne correspondent pas nécessairement. De plus, des études ont rapporté que les CECs en culture montraient une grande variabilité dans leur expression génique [62, 167]. Ceci pourrait donc expliquer les différences observées entre le profilage

baisse importante de la MMP-10 chez les populations DECF. Cette baisse était statistiquement significative parmi les CECs de morphologie intermédiaire. La MMP- 10 est une stromelysine qui est également en mesure de dégrader les éléments matriciels formant les guttae tels la fibronectine, la laminine et le collagène de type IV [129, 135]. Ainsi, la diminution de MMP-10 pourrait avoir un rôle dans l’accumulation anormale de MEC. Une explication possible pour les niveaux réduits de MMPs parmi les CECs DECF pourrait être en lien avec le TGF-ß. En effet, des études ont rapporté l’effet inhibiteur du TGF-ß sur l’expression de certaines MMPs dont les stromelysines [172]. De plus, des niveaux élevés de TGFßIp (TGF-ß- induced protein) ont été associés à la DECF [52]. Ce facteur de croissance pourrait donc contribuer à la baisse de stromelysine observée.

MMP1 était un des gènes les plus exprimés, particulièrement au niveau des CECs

DECF de morphologie fibroblastique. Les tests quantitatifs ont d’ailleurs montré des taux élevés de MMP-1 et elle a été observée à la hausse chez les populations DECF de morphologie intermédiaire. Cette MMP est une collagénase dégradant une variété de collagène (mais pas le collagène de type IV), la fibronectine et la lamine [129, 135]. Puisqu’une accumulation pathologique de MEC est présente dans la DECF, une baisse dans la dégradation de la MEC, et donc des MMPs, est attendue. Toutefois, la hausse de MMP-1 pourrait être expliquée par l’état oxydatif en lien avec le déséquilibre oxydant : antioxydant retrouvé dans la DECF [101, 102]. En effet, des études ont montré que les espèces réactives de l’oxygène (ROS), tel H2O2, favorisent l’expression de MMP1 et que de la même façon les antioxydants inhiberaient l’expression de MMP1 [173-175]. En effet, une hausse dans l’expression du gène MMP1 a été détectée chez les populations DECF.

Comme mentionné dans le premier chapitre, l’équilibre entre les MMPs et les TIMPs est un facteur important dans l’homéostasie de la MEC [153]. Les populations DECF ont montré un déséquilibre dans le ratio MMPs :TIMPs en exprimant une plus grande proportion de TIMPs par MMPs que les populations saines. Cette différence a été observée parmi toutes les morphologies, mais était seulement statistiquement significative pour le groupe intermédiaire. Aucune différence significative n’a été

détectée parmi les TIMPs, suggérant que le déséquilibre MMPs :TIMPs provient davantage d’un dérèglement au niveau des MMPs. Ces résultats pourraient expliquer le manque de dégradation de MEC ayant comme résultat une accumulation anormale de MEC dans la DECF. Un déséquilibre MMPs :TIMPs est d’ailleurs un facteur qui a été lié à différentes pathologies oculaires impliquant la MEC. Par exemple, plusieurs études ont montré une augmentation du dépôt de MEC en lien avec une baisse dans le ratio MMP :TIMP dans le glaucome à angle ouvert [176-178]. D’autres ont observé une hausse dans le ratio MMP:TIMP en lien avec une dégradation excessive de MEC dans le kératocône [179].

Peu d’études se sont intéressées au profil des MMPs et des TIMPs dans la DECF. Weller et al. ont examiné la régulation génique de quelques MMPs parmi des spécimens natifs DECF par PCR et ont rapporté une hausse au niveau de MMP9,

MMP10, MMP11, MMP14 et TIMP1 [31]. Une autre étude a rapporté le contraire,

soit une baisse de MMP10, MMP14 et TIMP1 dans la DECF [180]. De notre côté, nous avons analysé le transcriptome de CECs post-confluentes in vitro et avons trouvé des taux d’expression génique similaires (<2.0-fois) entre les CECs DECF et saines, à l’exception de MMP1 et TIMP3. La comparaison selon la morphologie révèle quelques différences non statistiquement significatives entre les CECs DECF et saines de morphologie fibroblastique : une hausse de MMP1, MMP3, TIMP3 et

TIMP4 et une baisse de MMP12 et MMP24. Une grande variabilité est présente au

niveau de l’expression génique de CECs en culture, ce qui rend plus difficile l’obtention de différences statistiquement significatives [62, 167]. De plus, ces résultats divergents pourraient aussi être expliqués par le type de spécimens utilisés puisque les CECs DECF en culture ne se comportent pas nécessairement de la même façon que les tissues natifs DECF. En effet, une étude antérieure effectuée par notre équipe révéla que la culture cellulaire pouvait potentiellement sélectionner les cellules moins atteintes de DECF et ainsi générer des cultures cellulaires de CECs « moins malades » [62, 167, 168].

l’expression génique de MMP1 était en concordance avec l’expression protéique de MMP-1 montrant une plus grande expression au niveau des CECs DECF que les CECs saines. De plus, les CECs DECF de morphologie intermédiaire ont montré une baisse de l’expression génique et protéique des MMP-3 et MMP-10 lorsque comparées aux CECs saines de morphologie similaire. Cependant, des observations contradictoires ont également été trouvées. Le groupe fibroblastique DECF a montré une hausse de l’expression génique de MMP1, MMP3, MMP10 et

TIMP4, mais une baisse de l’expression de ces protéines respectives. Des

observations similaires ont été faites au niveau des CECs de groupe intermédiaire au niveau de la MMP-2 avec une expression génique à la hausse, mais une expression protéique à la baisse. D’une part, ces résultats divergents pourraient être expliqués par le fait que les CECs utilisées pour le profilage génique n’étaient pas les mêmes que pour les tests quantitatifs. Les gènes et les protéines comparés n’étaient donc pas nécessairement correspondants. D’autre part, il est possible qu’une régulation post-transcriptionnelle soit la cause des différences observées puisque l’expression génique ne reflète pas nécessairement l’expression protéique. 2.1.2 Différences dans la proportion de MMPs activées

Notre étude a également la particularité d’avoir évalué l’activité des MMPs détectées. La majorité des MMPs sont sécrétées sous forme inactive et requièrent un clivage afin d’acquérir leur propriété protéolytique, elles existent donc sous deux formes : la proforme inactive et la forme active [128, 129]. Les tests d’activité nous ont donc permis d’établir si les différences identifiées par tests quantitatifs provenaient d’une forme particulière de MMP. Les activités des gélatinases et stromelysines étaient similaires entre les populations DECF et saines pour les MMP- 2, -9 et -10. Cependant, puisque ces MMPs se retrouvaient en plus petite quantité parmi les populations DECF, des niveaux d’activité similaires suggèrent une plus grande proportion de MMPs activées. Nos résultats ont d’ailleurs confirmé cela en montrant des proportions forme active : proforme plus élevées chez les populations DECF. Par conséquent, il est possible que malgré une quantité moindre de MMPs totales, les CECs DECF essaient de vaincre l’accumulation de MEC en activant une

plus grande proportion de MMPs. D’ailleurs, les ROS augmentées dans la DECF pourraient contribuer à ce phénomène en favorisant l’activation des MMPs. Des études ont montré une hausse de l’activité protéolytique de la MMP-2 en lien avec des niveaux élevés de H2O2 intramitochondrial [181, 182]. Cependant, il est possible que cette hausse dans l’activation des MMPs ne se traduise pas nécessairement par une dégradation de MEC augmentée. D’ailleurs, il est également possible que l’augmentation dans la dégradation de MEC ne soit pas suffisante pour compenser l’accumulation importante de MEC sous forme de guttae. En effet, afin d’arriver à un équilibre, une hausse dans le dépôt de MEC devrait être accompagnée par une hausse dans l’activité des MMPs parmi les CECs DECF et non des niveaux d’activité similaires aux CECs saines. De plus, l’activité de la MMP-2 détectée chez les populations DECF pourrait être surestimée en raison de l’électrophorèse effectuée durant la zymographie. Cette étape dissocie les MMPs couplées à des TIMPs lors de la migration [183] et peut donc détecter l’activité de MMP-2 préalablement inhibée par une TIMP.

2.1.3 L’influence de la morphologie cellulaire sur le profil des MMPs et TIMPs est différente dans la DECF

La TEM parmi les CECs n’est pas un processus qui a été énormément étudié. Cependant, nous savons que la TEM est un phénomène qui est souvent observé lors de la culture de CECs [62]. Plusieurs changements surviennent lors de la TEM dont un changement de la morphologie cellulaire, mais aussi une expression augmentée de certaines MMPs [161]. Nous avons donc décidé d’inclure la morphologie cellulaire dans nos analyses et avons observé que la morphologie est en effet un facteur influençant le profil des MMPs et TIMPs. De plus, cette influence semble différente entre les populations DECF et saines.

Différentes tendances ont été détectées dans la sécrétion de MMPs et TIMPs selon la morphologie. Des hausses dans la MMP-3 et la MMP-13 ont été détectées parmi les CECs saines de morphologie fibroblastique (morphologie associée à la TEM)

associé la MMP-3 à la TEM retrouvée au niveau des hépatocytes de carcinome hépatocellulaire [185]. D’autres ont rapporté une hausse de la MMP-13 (ARNm et protéine) associée à la TEM au niveau de tissus gingivaux [186]. Nous n’avons toutefois pas observé ces hausses au niveau des CECs DECF avec morphologie fibroblastique. Les niveaux de MMP-3 et MMP-13 étaient d’ailleurs similaires d’une morphologie à l’autre (différences <1.5-fois). Les CECs DECF semblent donc se comporter de façon différente que les CECs saines en ce qui concerne la sécrétion de MMP-3 et MMP-13 en fonction de la morphologie.

Les MMP-1, -9, -10 et -12 ont montré des tendances contraires, c’est-à-dire des niveaux plus élevés de MMPs au niveau de la morphologie endothéliale que la morphologie fibroblastique. Ces observations vont à l’encontre de ce qui a été décrit dans la littérature qui rapporte plutôt des niveaux plus élevés de MMPs associés à la morphologie fibroblastique [161, 187, 188]. Par exemple, des niveaux élevés de MMP-9 ont été associés à la TEM au niveau des cellules endothéliales glomérulaires rénales [189]. Outre l’expression augmentée de MMP-9, cette dernière a également été associée à la TEM par son activité de clivage de la N-cadhérine, une protéine de jonction cellulaire [190-192]. Par conséquent, l’activité des MMPs est aussi un élément important à considérer dans la TEM [193, 194]. D’ailleurs, Ho et al. ont montré que l’inhibition de MMPs pouvait inverser le processus de TEM [195]. Nous avons en effet observé des niveaux de TIMP-1 et TIMP-2 plus élevés au niveau des CECs de morphologie endothéliale que des CECs de morphologie fibroblastique. De plus, nos résultats montrent une hausse de l’activité de tous les MMPs testées (MMP-2, MMP-3, MMP-9 et MMP-10) associée aux CECs saines de morphologie fibroblastique. À l’exception de l’activité de la MMP-3, les CECs DECF n’ont pas montré les mêmes tendances. Même que l’activité de la MMP-2 était à la baisse au niveau des CECs DECF de morphologie fibroblastique. Ces observations suggèrent donc une certaine dérégulation au niveau de l’activité des MMPs chez les CECs DECF lorsque comparée aux CECs saines. Les activités des MMP-1 et MMP-12 n’ont malheureusement pas été testées. Nous ne savons donc pas si la hausse de l’expression protéique de ces MMPs se traduit par une augmentation de leur activité.

Dans l’ensemble, nos résultats montrent que la morphologie cellulaire influence le profil des MMPs et TIMPs et que les CECs DECF et saines sont influencées de façon différente. L’observation de différences entre le comportement des CECs DECF et saines suggère une certaine dérégulation au niveau du profil des MMPs et TIMPs des CECs DECF. Nous avons observé que les variations au niveau des MMPs et TIMPs des CECs saines suivaient de façon générale les tendances décrites dans la littérature concernant la TEM. En d’autres mots, l’effet de la morphologie sur le profil des MMPs et TIMPs de CECs saines semble être explicable par la TEM. Par contre, les CECs DECF ont montré des variations différentes ne suivant pas la TEM. Ceci suggère donc qu’il doit exister un élément autre que la TEM contribuant à la dérégulation des MMPs et TIMPs observée dans la DECF. De plus, une étude a rapporté que la morphologie cellulaire, dont la morphologie fibroblastique, peut déclencher des changements dans l’expression des MMPs [174], ce qui soulève la question : est-ce que la dérégulation des MMPs observée dans la DECF est le résultat d’un processus pathologique (c.-à-d. TEM/changements fibroblastiques) ou est-ce l’élément déclencheur (c.-à-d. dérégulation de MMPs causant la TEM)? Des études supplémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre cette dérégulation.

Tableau 5 Tableau synthèse. Résumé des MMPs et TIMPs retrouvées au niveau des populations DECF lorsque comparées aux populations saines. La deuxième colonne regroupe toutes les morphologies, tandis que les trois dernières

représentent les populations regroupées selon la morphologie. Se référer à la légende au bas du tableau pour l’ampleur des variations. (* Indique les différences statistiquement significatives, p=0,05) Toutes morphologies confondues Morphologie fibroblastique Morphologie intermédiaire Morphologie endothéliale MMPs proteins MMP-1 −  *  MMP-2 *  *  MMP-3    −

MMP-9 −   − MMP-10   *  MMP-12 − −   MMP-13   − − MMPs (total)   *  TIMPs proteins TIMP-1 − − − − TIMP-2 − − − − TIMP-4 −  − − TIMPs (total) − − − − MMPs/TIMPs   * 

Légende des variations : − : (< 2-fois)

 : faible (2-10-fois)  : moyenne (11-30-fois)  : importante (31-50-fois)  : très importante (>50-fois)

2.1.4 Identification d’une relocation de la MT1-MMP au niveau de spécimen FECD Nous avons choisi d’étudier la MMP membranaire MT-MMP1 (MMP-14) puisqu’elle a été la plus étudiée au niveau de la cornée et a également déjà été identifiée au niveau de l’endothélium cornéen [196]. En effet, nous avons détecté la MT1-MMP autant chez les tissus sains que DECF. Nous avons d’ailleurs observé une relocalisation de la MT1-MMP autour des guttae parmi les spécimens DECF, indiquant qu’outre la quantité et l’activité, des différences peuvent survenir dans la localisation des MMPs dans la DECF. Cette observation est importante puisque peu d’étude s’intéresse à la localisation des MMPs lors de pathologie. Cette relocalisation pourrait refléter une tentative de la part des CECs de dégrader les guttae. En effet, la MT1-MMP dégrade la fibronectine et la laminine et possède également la capacité à activer diverses MMPs, dont la MMP-2 [129]. Cependant, il est difficile de déterminer si les MT1-MMPs détectées par IF sont sous forme actives ou inactives. En effet, l’anticorps utilisé détecte une séquence du domaine catalytique et devrait donc détecter davantage les MMPs sous forme active puisque, comme mentionné précédemment, le propeptide de la forme inactive se replie sur

le domaine catalytique empêchant son exposition. Malheureusement, le manufacturier n’a pas pu confirmer cette information. La présence de MT1-MMPs autour des guttae pourrait être associée au détachement et à la perte des CECs en lien avec les guttae, observé dans la DECF. Une étude mentionne la capacité de la MT1-MMP d’induire une perte des molécules d’adhésion, modifiant ainsi les propriétés d’adhésion cellulaire [197]. De plus, la MT1-MMP a été associée au kératocône qui est également une maladie oculaire impliquant la MEC. Dans cette dernière, une dégradation exagérée de la MEC a été associée à une surexpression de la MT1-MMP observée par immunohistochimie [196]. Ainsi, nous avons également montré un dérèglement dans la distribution et localisation de la MT1- MMP au niveau de spécimens natifs DECF. Cette observation est importante puisque les spécimens natifs, contrairement au CECs in vitro, représentent les stades avancés de la maladie. La détection d’une dérégulation de MMP au niveau de spécimens natifs suggère donc une dérégulation qui est également présente dans les stades avancés de la maladie.