Résultats obtenus sur des neurones d’hippocampe d’embryons de rat

Après avoir réalisé les premières expériences sur des cellules HEK-293 et mis en évidence des variations de la proximité entre APP et BACE1 sous l’effet du cholestérol, nous avons effectué les mêmes expériences pour les deux types d’excitation en TIRF et en épifluorescence dans des neurones d’hippocampe d’embryons de rat (Fig.3.10).

Fig.3.10: Image d’intensité de fluorescence (à gauche), carte de répartition de durée de vie de fluorescence pixel par pixel (« TIRFLIM map », au centre) et combinaison d’intensité et de durée de vie (« photon-weighted TIRFLIM map », à droite) obtenues sur un neurone co-exprimant BACE1-GFP et APP-mCherry pour une excitation en TIRF. La durée de vie moyenne (ddv) et l’écart type (e-t) associés à la distribution de la durée de

vie de fluorescence de BACE1-GFP sont indiqués.

2.3.3.1 Avant ajout du cholestérol

Les résultats sont regroupés dans le tableau 3.3. En condition contrôle de cholestérol membranaire, la durée de vie de fluorescence du donneur est significativement diminuée en présence de l’accepteur APP-mCherry à la membrane plasmique des cellules (t-test avec correction de Welch

p = 0,006), ce qui indique que du FRET a lieu sous excitation TIRF (Tab.3.3). Nous en déduisons

donc que dans les neurones, avant l’ajout du cholestérol, il y a une proximité entre BACE1 et APP au niveau de la membrane plasmique. En épifluorescence, l’analyse statistique effectuée ne permet pas de différencier les deux populations mais est très proche du cas significatif.

Donneur Accepteur Illumination Temps après ajout du cholestérol Nombre de neurones Durée de vie moyenne du donneur ± sem (ps) p-value

Bace1-GFP - TIRF avant 72 2200 ± 7

Bace1-GFP APP-mCherry TIRF avant 64 2169 ± 8

** (p=0,006)

Bace1-GFP - Epifluorescence avant 58 2327 ± 11

Bace1-GFP APP-mCherry Epifluorescence avant 67 2294 ± 13

ns (p=0,0505)

a _{p-value obtenue avec un t-test non apparié (two-tailed unpaired t-test), sans a priori sur les échantillons avec une correction}

de Welch et un intervalle de confiance de 95%.

Tab. 3.3 : Durée de vie de fluorescence moyenne du donneur BACE1-GFP en présence ou en absence de l’accepteur de FRET APP-mCherry sous excitation TIRF ou en épifluorescence avant ajout du cholestérol dans

le milieu extracellulaire de neurones en culture.

Ces premiers résultats montrent donc qu’avant l’ajout du cholestérol, il existe déjà une interaction entre BACE1 et APP à la membrane plasmique des cellules que nous n’avions pas détectée en cellules HEK-293.

2.3.3.2 Effet aux temps courts après ajout du cholestérol (0-8 min)

Nous avons ensuite mis les neurones en présence d'1,4 mM de complexe MβCD-cholestérol au temps 0 et suivi la durée de vie de fluorescence du donneur pendant 30 minutes. Nous avons d'abord étudié l’effet du cholestérol sur la durée de vie de fluorescence de BACE1-GFP entre 2 et 8 minutes après l’ajout du cholestérol (Fig.3.11.A). Nous avons ainsi mesuré une pente de -0,5 ± 1,2 (n = 18) pour BACE1-GFP seul qui diminue à -4,0 ± 1,2 (n = 23) en présence de l’accepteur (t-test non apparié

p = 0,048). L’augmentation du cholestérol membranaire se traduit donc par une diminution de la pente

associée aux mesures de durée de vie de fluorescence de la GFP en présence de la mCherry entre 2 et 8 minutes après l'ajout de cholestérol, en comparaison avec les mesures où le donneur était seul (Fig.3.11.B). Comme les mesures de FLIM/FRET sont indépendantes de la concentration du fluorophore, nous en déduisons que la diminution de la pente correspond à la diminution de la durée de vie du donneur en présence de l’accepteur. Cela traduit donc une augmentation du FRET et par conséquent une plus grande interaction entre BACE1-GFP et APP-mCherry aux temps courts (< 8 min) après ajout du cholestérol, avant l'endocytose.

Les mêmes mesures ont été effectuées avec une excitation en épifluorescence. Nous avons ainsi mesuré une pente de -5,2 ± 3,0 correspondant aux durées de vie de BACE1-GFP seul (n = 13) entre 2 et 8 minutes après ajout du cholestérol contre -4,1 ± 2,3 pour BACE1-GFP en présence d’APP- mCherry (n = 24). Le test de Student ne permet pas de différencier ces deux populations (t-test non apparié p = 0,7821, ns) (Fig.3.11.C). Nous en avons déduit qu’aux temps courts le cholestérol n’a pas d’effet sur la proximité entre BACE1 et APP au niveau du cytoplasme de la cellule.

Fig. 3.11 : Augmentation du FRET aux temps courts après l’ajout du cholestérol à la membrane plasmique des neurones mais pas dans le cytosol. Les cultures primaires d’hippocampe d’embryons de rat étaient exposées à

1,4 mM MβCD cholestérol. (A) Variations représentatives de la durée de vie de fluorescence du donneur BACE1-GFP en présence ( ) ou en absence de l’accepteur APP-mCherry ( ) en fonction du temps d’exposition au cholestérol sous excitation TIRF (■) ou en épifluorescence (▲). (B) &(C) Calcul de la pente

entre 2 et 8 minutes pour les cinétiques obtenues, pour BACE1-GFP seul (blanc) ou en présence d’APP- mCherry (noir) sous excitation TIRF (B) ou en épifluorescence (C) ns : non significatif. * p < 0,005 t-test non

apparié avec un intervalle de confiance de 95%.

Ainsi l'augmentation du cholestérol membranaire entraîne une augmentation de la proximité entre BACE1 et APP spécifiquement à la membrane plasmique des neurones.

2.3.3.3 Effet aux temps longs après ajout du cholestérol (30 min)

Les mêmes mesures que celles effectuées avant l’ajout du cholestérol ont été faites 30 min après cet ajout pour une excitation en TIRF et en épifluorescence (Tab.3.4). A la membrane plasmique des cellules aux temps longs après l’ajout du cholestérol, l’analyse statistique (t-test non apparié avec correction de Welch, p = 0,1897) ne permet pas de différencier les durées de vie de BACE1-GFP en présence ou en absence de l’accepteur APP-mCherry. Nous ne retrouvons donc pas la proximité entre BACE1 et APP à la membrane plasmique, que nous avions détectée avant l’ajout du cholestérol.

En excitation en épifluorescence, 30 minutes après l’ajout du cholestérol, nous avons constaté que la durée de vie de fluorescence du donneur BACE1-GFP était significativement diminuée en présence de l’accepteur APP-mCherry (t-test non apparié avec la correction de Welch, p = 0,0009). Nous en avons donc déduit que du FRET a lieu entre BACE1-GFP et APP-mCherry (Tab. 3.4). Ainsi, après 30 minutes d’exposition au cholestérol, APP et BACE1 sont à proximité dans l’espace cytoplasmique du neurone.

Donneur Accepteur Illumination Temps après ajout du cholestérol Nombre de neurones Durée de vie moyenne du donneur ± sem (ps) p-value

Bace1-GFP - TIRF 30 min 92 2191 ± 10

Bace1-GFP APP-mCherry TIRF 30 min 83 2169 ± 13

ns (p = 0,1897)a

Bace1-GFP - Epifluorescence 30 min 57 2363 ± 18

Bace1-GFP APP-mCherry Epifluorescence 30 min 74 2291 ± 11

***(p = 0,0009)a

a _{p-value obtenue avec un t-test non apparié (two-tailed unpaired t-test), sans a priori sur les échantillons avec une correction}

de Welch et un intervalle de confiance de 95%.

Tab. 3.4 Durée de vie de fluorescence moyenne du donneur BACE1-GFP en présence ou en absence de l’accepteur de FRET APP-mCherry sous excitation TIRF ou en épifluorescence 30 min après l’ajout du

cholestérol dans le milieu extracellulaire de neurones en culture.