Evaluation de la profondeur de pénétration de l’onde évanescente sous excitation SPETIRF

Il a déjà été montré que la présence d’une surface d’or induit des changements de la durée de vie de fluorescence des molécules en fonction de leur distance au métal. L’équipe de D. Richards a ainsi retrouvé le déclin mono-exponentiel de fluorophores dans des microsphères, placées sur une surface d’or, en utilisant un microscope confocal [120].

Dans le but de trouver un système nous permettant d’effectuer une mesure de la profondeur de pénétration de l’onde évanescente, nous avons cherché à observer des diminutions de la durée de vie de fluorescence lors du passage d’une excitation en épifluorescence à une configuration en TIRF puis en SPETIRF. Pour cela, nous avons observé des billes FocalCheck (10 à 15 µm) ayant un marquage uniquement sur leur surface. Sur ces billes, nous voulions mettre en évidence des différences de durée de vie de fluorescence du point de contact entre la bille et le métal pour les différentes configurations d’excitation. Les échantillons utilisés sont des lamelles de verre dont une partie est recouverte de plusieurs dépôts métalliques (Fig.2.29). Ces dépôts sont composés d’une fine épaisseur de chrome pour favoriser l’adhésion de l’argent (2 nm), d’une couche d’argent (50 nm environ) et d’une fine couche d’or (2 nm) pour protéger la couche d’argent. Ces échantillons nous permettent ainsi de faire des mesures de durée de vie de fluorescence sur le verre et sur le métal.

Fig.2.29 : Schéma simplifié des surfaces plasmoniques utililisées.

Nous avons choisi comme échantillon des billes de 15 µm en polystyrène n’ayant un marquage que sur leur surface (FocalCheck microspheres, 15 µm, fluorescent blue orange ring stains,

Invitrogen). Ces billes possèdent un double marquage en surface dans le bleu (exc : 365 nm/

em : 430 nm) et dans l’orange (exc: 560 nm/ em : 580 nm). Elles sont communément utilisées pour effectuer des calibrations des lasers confocaux notamment pour l’alignement et la séparation spectrale de multiples voies laser et voies de détection. Nous avons donc utilisé ces billes en suspension dans l’eau puis nous les avons déposées sur notre échantillon métallique. Celui-ci avait été préalablement placé dans un support de lamelle (Attofluor, Invitrogen), qui facilite l’accès à l’échantillon et permet de recouvrir l’échantillon de la solution d’intérêt, avec la face métallique orientée vers le dessus pour que l’excitation se fasse en configuration de Kretschmann. Pour l’excitation et la détection, nous avons utilisé le cube TXRED.

Après avoir effectué la mise au point sur une bille, nous avons déplacé la platine de translation pour passer d’une excitation en épifluorescence à une excitation au-delà de l’angle critique puis en SPETIRF. Nous avons repéré les positions de la platine correspondant à chaque type d’excitation, en suivant l’augmentation de l’intensité de fluorescence sur la caméra EMCCD de la voie de détection en intensité (Fig.2.5). Nous avons alors observé une augmentation de l’intensité de fluorescence d’un facteur 5 entre l’excitation en TIRF par rapport à l’excitation en SPETIRF (Fig.2.30), ce qui est en accord avec les études précédentes [121].

Fig.2.30 : Variations de l’intensité de fluorescence de billes marquées en surface déposées sur un support métallique, lors de l’augmentation de l’angle d’incidence sur l’échantillon faisant passer d’une excitation en

épifluorescence à une excitation en TIRF puis en SPETIRF.

Etant donné la variation précédente de l’intensité de fluorescence en fonction de l’angle d’incidence sur l’échantillon, nous nous sommes ensuite positionnés aux angles correspondant à une excitation en TIRF et en SPETIRF et nous avons effectué des mesures de durée de vie de fluorescence pour chacune des trois conditions d’excitation en utilisant la voie de détection FLIM. Pour cela, nous nous sommes tout d’abord placés à l’angle de résonance du plasmon pour effectuer la mise au point et trouver le bon plan de focalisation. Il correspond au point de contact de la bille avec la surface métallique et à la position où la diffusion est la moins importante. En effet, l’observation des billes est entachée d’une diffusion assez conséquente liée à leur composition en polystyrène qui a un indice plus élevé que le milieu aqueux environnant (Fig.2.31.A). Nous avons observé un halo lumineux dont le centre est noir, en raison du quenching de la fluorescence par le métal au niveau du point de contact. Ensuite nous avons déplacé la platine de translation pour passer en excitation TIRF puis en épifluorescence sans modifier la mise au point. Pour l’acquisition pour chacune des trois positions d’excitation, nous avons utilisé le mode Comb Low avec 19 portes temporelles de 800 ps de largeur, pour bien échantillonner le déclin de fluorescence. Dans ces conditions, nous avons mesuré la durée de vie moyenne de fluorescence du point de contact de plusieurs billes (Tab.2.2. & Fig.2.31.B).

Excitation en épifluorescence Excitation en TIRF Excitation en SPETIRF

Ddvm (ps) SEM (ps) N Ddvm (ps) SEM (ps) N Ddvm (ps) SEM (ps) N

4340 15 11 4492 17 11 3961 15 11

Tab.2.2 : Durée de vie moyenne (Ddvm) du point de contact de la bille avec la surface métallique et erreur à la moyenne associée (sem) sur un nombre N d’échantillons, pour les trois conditions d’illumination

Fig.2.31: (A) Exemple d’une image en intensité de fluorescence du point de contact d’une bille excitée en SPETIRF. (B) Variations de la durée de vie de fluorescence du point de contact de billes placées sur une surface

métallique, pour différentes conditions d’illumination.

Nous avons constaté que les différences de durée de vie entre les trois conditions d’illumination sont significatives (Fig.2.31.B). En effet, une analyse statistique t-test non apparié et sans a priori permet de dissocier les populations en comparant deux à deux les trois conditions d’excitation (p < 0,0001, ***). De plus, les durées de vie de fluorescence mesurées en excitation en épifluorescence (Fig.2.32.A) et sous excitation TIRF (Fig.2.32.B), sont supérieures à celles obtenues sous excitation SPETIRF (Fig.2.32.C). Nous avons donc observé une diminution de la durée de vie de fluorescence sous excitation SPETIRF.

Fig.2.32: Exemples de mesure de durée de vie de fluorescence du point de contact de billes placées sur une surface métallique pour différentes conditions d’illumination, en épifluorescence (A), en TIRF (B), en

SPETIRF (C).

Sous excitation SPETIRF, nous avons mesuré localement des différences de durées de vie en fonction de la distance au centre de la bille, comme cela avait été mis en évidence précédemment [112], [120]. On peut relier ces différences de durée de vie à la distance des fluorophores par rapport à l’interface métallique à l’aide du modèle précédent (Fig.2.25). Les mesures de durée de vie de fluorescence effectuées sous excitation SPETIRF correspondraient à des fluorophores situés dans les 120 premiers nanomètres par rapport à la surface métallique. Sous excitation TIRF, nous avons obtenu une durée de vie moyenne qui est supérieure à celle obtenue en épifluorescence (Tab.2.2). D’après la figure 2.25, cette augmentation serait liée aux oscillations de la durée de vie de fluorescence des fluorophores situés à une distance comprise entre 120 et 220 nm par rapport à au métal. Un programme sous Matlab est en cours de développement dans notre équipe pour déterminer localement, pour chaque pixel de l’image, la distance des fluorophores par rapport à l’interface à l’aide des mesures de durée de vie de fluorescence.