4.2.1 Contournement des problèmes dus aux impuretés de l'ex-trait
Très souvent les extraits contiennent encore de nombreuses impuretés, débris mem-branaires, agrégats d'actine etc... Elles sont elles aussi capturées dans le piège optique, et viennent s'agréger sur notre bille. Le bruit sur notre signal augmente rapidement, mais en plus, la relation reliant constante de raideur du piège et la puissance du laser utilisée devient vite inutilisable ; selon la qualité de l'extrait, le temps d'une expérience peut varier entre 20 s. et 20 mn.
Fig. 4.3 Schéma de notre cellule expérimentale avant et après modication pour travailler avec l'extrait d'÷ufs de Xenopus Laevis. Pour réduire la pollution de notre bille piégée par les impuretés présentes dans l'extrait d'÷ufs de Xenopus Laevis, nous rapprochons la micro-pipette de la paroi inférieure de la chambre en la courbant avec un micro-levier (un morceau d'une autre micro-pipette).
Pour augmenter ce temps exploitable, il ne faut utiliser une puissance laser importante (∼800 mW) que pendant la phase d'étirement ; nous réduisons à 200 mW (puissance laser en sortie de tête) la puissance pendant l'incubation ADN + extrait.
Les particules susceptibles d'être piégées sont celles qui se trouvent en amont du point focal du faisceau laser, celles se trouvant en aval sont éjectées par la pression de radiation
d'÷ufs de Xenopus Laevis est représenté sur la Fig (4.4).
Fig. 4.4 Diagramme d'étirement d'une bre chromatine reconstituée avec de l'ex-trait d'÷ufs de Xenopus Laevis. En dents de scie, ce prol est très diérent du prol d'ex-tension d'une molécule d'ADN nue. Chaque dent est attribuée à la libération brusque de l'ADN impliqué dans un ou plusieurs nucléosomes ou même,éventuellement, dans d'autre structures de type boucle d'ADN. Avec l'extrait, il est également probable que certain pics correspondent aussi à la libération d'ADN engagé dans des structures autres qu'un nucléosome. Ici, en n, d'étirement l'ADN se détache de l'une des billes.
Les distributions en forces de rupture et en longueurs d'ADN libérées sont relativement larges. Soucieux de ne pas biaiser nos résultats nous avons tenu compte de tous les pics observés, même si certaines longueurs pourraient plutôt correspondre à de grandes boucles d'ADN ou à des structures plus étendues qu'un simple nucléosome.
Nous avons procédé à un grand nombre d'étirements, collectant ainsi un échantillon de pics pertinents pour procéder à son analyse : plus de 420 pics pour les expériences de références, avec la protéine B4 présente.
Fig. 4.5 Histogramme des longueurs libérées lors des phénomènes de rupture. Etirements sur des bres de chromatines reconstituées avec un extrait d'÷ufs de Xenopus Laevis contenant la protéine B4. Lignes continues : Ajustement de deux gaussiennes, en rouge avec les longueurs moyennes libres et en bleu avec pour contrainte la deuxième longueur qui est le double de la première. Une longueur de 68 nm se dégage nettement de la distribution. La longueur double, supposée correspondre à la rupture simultanée de deux nucléosomes, est noyée dans la queue de la distribution. Insert, histogramme de la distribution des forces de rupture lors de l'étirement de cette bre de chromatine et ajustement avec une gaussienne (courbe en bleu)
L'histogramme (Fig 4.5) révèle une longueur autour de 68 nm ± 1.7 nm (SE) et une autre, plus étalée, autour de 114 nm ± 4.7 nm (SE). La distribution en forces de type gaussienne, est centrée autour de 21 pN± 0.6 pN (SE).
Dans la plupart des expériences sur l'extrait d'÷ufs de Xenopus Laevis ou de droso-phile, l'ADN n'est pas initialement tendu. Pourtant nous remarquons une diminution très nette de la distance entre les deux billes à mesure que la bre de chromatine se constitue. Le piège restant xe, une force de résistance à la formation de la bre apparait, et peut atteindre 8-10 pN avant que la distance entre les billes ne se stabilise. Ensuite, le prol d'étirement n'est pas modié et reste en dents de scie.
Fig. 4.6 Autre exemple typique d'étirement d'une bre de chromatine reconstituée avec l'extrait de Xenopus Laevis. Cette fois la relaxation est bien visible et semblable à celle d'un ADN nu. Les nucléosomes ne se reconstituent pas au fur et à mesure que la force décroît. Par contre, comme nous pouvons le constater sur ce prol d'étirement, la bre de chromatine peut se former sur une molécule d'ADN jusqu'à ce que la force de tension soit comprise entre 4 et 10 pN ; èche noire sur cette gure et sur Fig (4.5).
Dans ce type d'expérience, nous ne disposons que de très peu de molécules d'ADN, quasiment seulement celles qui sont attachées à la bille, les autres étant rincées avant l'arrivée de l'extrait. La qualité de l'extrait est très variable, et il n'est pas rare d'observer des fragments de membranes ou autres petits "aérolithes" en suspension, susceptibles de se faire happer par le piège, venant ainsi polluer notre signal. La durée d'incubation, limitée donc par la contamination de notre bille, pourrait être insusante pour reconstituer une bre de chromatine complète, si l'on s'en tient au temps caractéristique de 1 h [136][43] évoqué dans la communauté des biologistes. Pourtant une autre étude détermine un temps de formation bien diérent, plutôt de l'ordre de la minute [80], plus proche de nos premiers résultats. Nous avons donc procédé à l'expérience suivante pour avoir un ordre de grandeur de la cinétique de formation de la chromatine dans nos conditions expérimentales et pour savoir si les bres reconstituées en si peu de temps étaient bien formées :
Avant l'introduction de l'extrait, nous étirons une molécule d'ADN longue de 10 kbp jusqu'à sa longueur curvilinéaire (force∼3 pN), puis nous réduisons de 300 nm la distance
entre les billes. La longueur disponible d'ADN autorise, en théorie, la formation de 4-5 nucléosomes complets (∼ 200 bp soit 68 nm par nucléosome) avant que l'ADN ne soit sous tension, empêchant ainsi l'addition de tout nucléosome en plus. L'extrait est ensuite introduit. Après une incubation de 3 mn nous étirons une première fois la molécule puis nous ajoutons 900 nm d'ADN libre de plus. Pour ce deuxième étirement, ce sont alors 1200 nm d'ADN qui sont diponibles pour former des nucléosomes. Après le même temps d'incubation, soit 3 mn, nous procédons au deuxième étirement. Les résultats sont représentés Fig (4.7). Les longueurs libérées au cours de ces deux phases correspondent bien à 300 et 1200 nm, et les nombres de pics attendus sont eux aussi conformes à ce que nous attendions : conformes au nombre de nucléosomes susceptibles de se former sur l'ADN non étiré. Dans ces conditions, la bre de chromatine est rapidement formée, en comparaison avec les temps de référence employés en biologie moléculaire.
De plus un autre série d'expériences vient conrmer les résultats de cette première approche, et nous indique elle aussi clairement un temps d'incubation court pour aboutir à la formation d'une bre de chromatine (Fig 4.8).
Reconstitution en présence d'ADN compétiteur
Toujours pour étudier ce problème de cinétique de formation de la chromatine à partir d'extrait, et comprendre les quelques discordances concernant celle-ci, nous avons re-gardé l'inuence de l'addition d'ADN compétiteur. En eet, la diérence majeure entre ces expériences sur molécule unique et celles opérées classiquement dans les laboratoires de biologie est le rapport (quantité d'ADN)/(quantité de protéines), très faible dans le premier cas, et proche des conditions physiologiques dans le deuxième.
Avant d'injecter l'extrait dans notre chambre nous lui avons ajouté une quantité d'ADN telle que la concentration nale en ADN soit de 50 ng/µl, ce qui correspond à des condi-tions caractéristiques employées en biologie moléculaire. Les étirements sur la molécule d'ADN exposée à cet extrait contenant de l'ADN compétiteur sont ensuite eectués. Même en accroissant le temps d'incubation entre chaque phase d'étirement (10 mn, 20 mn, 35 mn), il n'apparait aucune structure évoquant la rupture d'un nucléosome complet dans le diagramme force-extension. Néanmoins, la réponse à l'étirement est susamment dié-rente de celle d'une molécule d'ADN nue pour supposer la xation de protéines de façon non spécique sur l'ADN (Fig 4.9).
4.2.4 Eet du tampon
Ainsi une incubation dans l'extrait de quelques minutes sut pour constituer des nucléosomes sur notre molécule d'ADN. Ceux-ci sont a priori brisés lors de l'étirement. En eet, en étirant successivement la même molécule d'ADN en des temps rapprochés, le premier étirement souligne clairement la présence de nucléosomes, mais le second, si il a la même amplitude (en force) que le premier, ne présente quasiment aucun pic dans son
Fig. 4.7 Prols d'étirements successifs : étude du nombre de nucléosomes constitués avec la longueur d'ADN laissée libre. Dans une première étape nous réglons l'extension de la molécule d'ADN entre nos deux billes de façon que seulement LDN A−Lbille−bille=L0= 300
nm soient disponibles pour former une bre avec l'arrivée de l'extrait. Le premier cycle extension-relaxation est eectué dans l'extrait et est suivi d'une deuxième phase d'incubation de 3 mn lors de laquelle nous avons réduit la distance entre les deux billes par rapport au premier étirement,
L0 = 1200nm. Le prol du deuxième étirement est ponctué de plus de pics que le premier, quatre fois plus environ, conformément à ce que nous attendons si ces pics sont bien la signature de la rupture de nucléosomes. a), déroulement de l'expérience, signal recueilli non traité. b), isolation du signal des deux étirements. c), conversion en force et en extension.
Fig. 4.8 Prols d'étirement successif d'une bre reconstituée dans l'extrait : étude de la vitesse de formation de la bre. Entre deux étirements successifs, les nucléosomes n'ont pas le temps de se reconstituer : nous n'observons pas ou peu de ruptures sur les étirements immédiatement suivants. Mais en attendant quelques minutes, la bre est reconstituée.
Fig. 4.9 Prol d'étirement d'ADN dans l'extrait de Xenopus Laevis, avec ADN compétiteur. [ADNcomp´etiteur]=50 ng/l. En pointillé, courbe d'étirement d'une molécule d'ADN nu semblable.
était alors de 10 mM PIPES, 0.4M NaCl. Pour expliquer ce phénomène, nous supposons que nous avons, dans ces conditions, cassé les liaisons histontes histone, en particulier dimères-tétramères, mais que les liaisons histones-ADN sont conservées. les constituants de l'octamère ne sont alors pas libérés dans la solution et peuvent reconstituer un nu-cléosome plus ou moins complet après une attente susamment longue (de l'ordre de 5 mn).
4.2.5 Déplétion de la protéine B4
Une autre étude mentionne une longueur caractéristique de rupture du nucléosome reconstitué avec l'extrait d'environ 64 nm [21]. Cette longueur est trop importante pour correspondre à l'ADN enroulé autour d'un seul octamère. La présence à la sortie de la NCP du substitut de l'histone de liaison dans l'extrait, la protéine B4, est une des explications envisagées. Pour tester cette hypothèse, nous avons conduit le même type d'expériences avec un extrait sans B4. Nous n'avons pas observé de diérence majeure entre les deux distributions, avec ou sans B4 (Fig 4.10), même si les ruptures de petites longueurs d'ADN semblent plus nombreuses pour les bres reconstituées avec l'extrait sans B4. Nous devons encore conrmer ce résultat, car nous rencontrons avec l'extrait des problèmes inhérents aux expériences sur molécules uniques (cf p.155).