b Résultats de l’évaluation de l’activité antibactérienne des ciments

Ciments chargés en argent

Dans un premier temps, l’activité antibactérienne a été évaluée sur le ciment C-REF – sans argent – d’une part, et sur des ciments C-Ag(S) contenant 3,75.10-2 % à 7,5 % (m/m) d’argent d’autre part. Ainsi, nous avons pu noter que le ciment C-REF ne présentait pas d’activité antibactérienne significative – même densité microbienne après 72 heures d’incubation que les témoins puits de microplaque – et autorisait la formation d’un biofilm dense à sa surface, avec une population adhérée supérieure à 6 log (Figure 5.2, point gris). Sur les compositions contenant de l’argent, que ce soit pour S aureus ou S. epidermidis on note une inhibition significative de la formation du biofilm. Jusqu’à une concentration de 3,75.10-2 % (m/m) en argent introduit sous forme Ag3PO4 dans la phase solide du ciment : le nombre de bactéries à la surface du ciment est inférieure à 3 log (limite de détection dans les conditions d’essai) (Figure 5.2.a & b, points rouges). [62]

Dans le but de mettre en exergue l’effet dose de l’argent et de déterminer les limites de son effet, nous avons cherché à diminuer encore sa concentration. La voie solide C-Ag(S) s’est alors

62

Le protocole utilisé ne permettant pas un dénombrement significatif inférieur à 103 UFC.cm-2 S. aureus ou S. epidermidis 48h milieu BBM (2 cm3₎ biofilm ? pastille de ciment (Ø 10,6 mm)

Chapitre 5 – Propriétés biologiques des ciments composites chargés en argent

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avérée délicate et des compositions de plus faibles concentrations en argent sont apparues difficiles à mettre en œuvre expérimentalement sur quelques grammes de ciment. Nous avons donc choisi de réaliser des ciments C-Ag(L), deuxième voie d’insertion de l’argent proposée dans le chapitre 3, où l’agent antibactérien est introduit par le biais d’une solution de nitrate d’argent – ce qui autorise des concentrations beaucoup plus faibles d’ions Ag+. Trois nouvelles compositions ont alors été préparées : un ciment C-Ag(L)_10-2_{, comme point de comparaison avec le ciment C-Ag(S) _10}-2_{, et les} ciments C-Ag(L)_10-4 et C-Ag(L)_10-6 d’un facteur de dilution 10-2 et 10-4 respectivement par rapport à ces derniers ciments.

La Figure 5.2 (points verts) présente les résultats obtenus pour ces ciments C-Ag(L). Nous pouvons ainsi remarquer que pour une même quantité d’argent, le ciment C-Ag(L)_10-2 semble présenter une activité antibactérienne moins prononcée que le ciment C-Ag(S)_10-2 – et ce pour les deux souches testées – mais toujours notable : le nombre de bactéries a été diminué de 2 à 3 log. Lorsque la quantité d’argent a été diluée d’un facteur 100, l’adhésion et la prolifération de S. aureus sous forme de biofilm à la surface des ciments n’a plus été freinée. Dans le cas de S. epidermidis, une légère diminution (-1 log(UFC/cm2)) est restée significative pour les ciments C-Ag(L)_10-4 et C-Ag(L)_10-6 par rapport au ciment C-REF, mais non suffisante par rapport à nos objectifs.

Figure 5.2 – Evaluation de l’activité antibactérienne (anti-biofilm) des ciments C-REF,

C-Ag(S)_10-1, C-Ag(S)_10-2, C-Ag(L)_10-2, C-Ag(L)_10-4 et C-Ag(S)_10-6 contre les souches S.

aureus et S. epidermidis.

Il apparaît donc, d’après ces résultats, qu’une concentration d’au moins 3,75.10-2 % (m/m) d’argent en phase solide du ciment CaCO3 – CaP permettrait de prévenir l’adhésion bactérienne et/ou la multiplication des bactéries adhérées.

Notons que des essais préliminaires ont été réalisés pour évaluer le potentiel antimicrobien du surnageant, après l’essai : celui-ci n’a pas montré d’effet significatif sur des cellules planctoniques.

10-8 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100 0 1 2 3 4 5 6 7 C-REF C-Ag(S) C-Ag(L) 10-8 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100 0 1 2 3 4 5 6 7 C-REF C-Ag(S) C-Ag(L) S. aureus S. epidermidis log( U FC /c m 2) log(U FC /cm 2) Pas d’attachement de bactéries en surface Pas d’attachement de bactéries en surface

Substitut osseux injectable, antibactérien et résorbable : études physico-chimiques et biologiques d’un ciment composite à base d’apatite

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Cela signifie donc que le relargage de l’argent de la pastille est faible, en accord avec les essais préliminaires de libération in vitro (Chapitre 4 - § 7)d’une concentration dans la solution inférieure à la concentration minimale inhibitrice (CMI) et à la concentration minimale bactéricide (CMB), de l’ordre de 1-10 ppm.

Ciments composites chargés en argent

Les résultats du chapitre 4 nous ont menés à la conclusion qu’une teneur de 10 % (m/m) de CMC, introduite sous forme de poudre dans la phase solide du ciment, permettait d’obtenir un ciment composite cohésif et injectable (Chapitre 4, § 3.4). Par ailleurs, nous venons de présenter les résultats d’une deuxième série d’analyses réalisée pour étudier l’impact de l’introduction du polysaccharide sur les propriétés antibactériennes du ciment chargé en argent à une concentration de 3,75.10-2 % (m/m) dans la phase solide.

Le Tableau 5.2 présente les résultats issus de cette série de tests sur des ciments composites chargés en argent (avec CMC introduite sous forme de poudre). Nous pouvons ainsi tout d’abord remarquer que l’introduction de 10 % de CMC a un impact sur les propriétés antibactériennes du matériau : la quantité de bactéries dénombrées était moindre d’environ 1,5 log dans C-10pCMC que dans C-REF, et ce pour les deux souches. Il a été noté dans la littérature qu’en milieu hydraté, la CMC formait un gel capable d’encapsuler et d’immobiliser des bactéries, notamment S. aureus [Walker 2003]. Il est donc possible que la quantité de CMC présente en surface de l’échantillon ait cette faculté de piéger une partie des bactéries.

Les ciments composites chargés en argent C-10pCMC/Ag(L)_10-2 et C-10pCMC/Ag(S)_10-2 n’ont pas présenté, comme nous aurions pu l’espérer, un effet synergique des deux additifs (CMC et Ag) sur les propriétés antimicrobiennes : les résultats sont du même ordre de grandeur avec ou sans CMC. L’activité antibactérienne des ciments p-composites chargés en argent est cependant démontrée puisque nous retrouvons dans cette série d’essais des réductions de l’ordre de 3 log (Tableau 5.2).

Chapitre 5 – Propriétés biologiques des ciments composites chargés en argent 179 Nombre de bactéries exprimées en log (UFC/cm2) S. aureus S. epidermidis Puits vide 6,58 ± 0,15 (3) 6,33 ± 0,09 (3) C-REF 5,71 ± 0,05 (2) 5,67 ± 0,32 (3) C-10pCMC 4,10 ± 0,14 (2) 4,33 ± 0,34 (3) C-Ag(L)_10-2 _{3,06 ± 0,02 (2) 3,16 ± 0,22 (3)} C-10pCMC/Ag(L)_10-2 _{3,26 ± 0,12 (2) 2,93 ± 0,10 (3)} C-Ag(S)_10-2 _{3,62 ± 0,18 (2) 3,39 ± 0,09 (2)} C-10pCMC/Ag(S)_10-2 _{3,70 ± 0,09 (2) 3,32 (1)}

Tableau 5.2 – Evaluation de l’activité antibactérienne de ciments contenant ou non de la

CMC – 10 % (m/m) sous forme de poudre (en orange) – et/ou de l’argent – 3,75.10-2 %

(m/m) introduit par voie liquide Ag(L) (en vert) ou solide Ag(S) (en rouge).

Les valeurs moyennes et écart-types (en italique) sont issus d’un nombre d’essais précisé entre parenthèses.

Ces essais microbiologiques ce sont ainsi avérés probants : que ce soit en introduisant l’argent par voie liquide sous forme de AgNO3 ou directement par voie solide sous forme de Ag3PO4, la possibilité de conférer des propriétés antibactériennes à des systèmes CaCO3 – CaP – Ag et CaCO3 – CaP – CMC – Ag a été démontrée. Des concentrations de 3,75.10-2 % à 7,5 % (m/m) d’élément Ag dans la phase solide des ciments ont ainsi permis d’inhiber la formation de biofilm des souches

S. aureus et S. epidermidis en surface des matériaux.

Des essais complémentaires sont en cours afin d’abaisser la limite de détection (dénombrement des bactéries) et de pouvoir définir s’il s’agit d’une inhibition totale de formation de biofilm ou d’une réduction partielle.

Compte tenu de la large gamme de concentrations en Ag testées et efficaces d’un point du vue bactériologique, nous nous sommes ensuite préoccupés de vérifier la cytocompatibilité de telles formulations de ciments (composites ou non) chargés en Ag vis-à-vis des cellules.