Résultats et discussions

Après migration sur gel d’agarose, les profils obtenus sont visionnés et photographiés par le système E-BOX VX2, un traitement par un logiciel spécifique (E-capt) est indispensable pour la détermination des tailles des Bandes RAPD obtenues. Les résultats obtenus après traitement sont ainsi représentés :

Chapitre IV : Mise En Evidence De La Variation Somaclonale Par Marqueurs

Moléculaires

Chapitre IV : Mise En Evidence De La Variation Somaclonale Par Marqueurs

Moléculaires

93

Figure 25 : Produits RAPD obtenus par une amplification PCR et neufs différentes

amorces (OPC-05, OPG-09, OPE-13, OPF-20, OPA-17, OPO-05, OPO-06, OPO-03, B-19) d’ADN isolées à partir des six génotypes de blé dur régénérés sous différentes conditions de culture. 2-Waha régénéré (in vitro) avec 16% NaCl après acclimatation. 3-Waha régénéré (in vitro) avec 16% NaCl avant acclimatation. 4-Waha Témoin (ex vitro) en absence de NaCl. 5-Waha Témoin (ex vitro) en 16% NaCl. 6-Beliouni régénéré (in vitro) avec 16% NaCl. 7-Beliouni Témoin (ex vitro) en 16% NaCl. 8-Beliouni Témoin (ex vitro) in absence of NaCl. 9-Gemgum Khem régénéré (in vitro) avec 16% NaCl. 10-Gemgum Khem Témoin (ex vitro) en absence de NaCl. 11-Adna-2 régénéré (in vitro) avec 16% NaCl. 12-Adna-2 Témoin (ex vitro) en 16% NaCl. 13-Adna-2 Témoin (ex vitro) en absence de NaCl. 14-Beni mestina Témoin (ex vitro) en 16% NaCl. 15-Beni Mestina Témoin (ex vitro) in absence of NaCl. 16-Adna-1 régénéré (in vitro) avec 16% NaCl. 17-Adnan-1 Témoin (ex vitro) en absence de NaCl. 18- Adna-1 Témoin (ex vitro) en 16% NaCl. 1: Marqueur de taille a droit de l’image.

5000 pb 1500 pb 100 pb 300 pb 500 pb 100 pb 300 pb 500 pb 5000 pb 1500 pb

Chapitre IV : Mise En Evidence De La Variation Somaclonale Par Marqueurs

Moléculaires

94

Tableau.25: Taux de polymorphisme des six variétés de blé dur obtenus avec les neuf

amorces RAPD : OPC-05, OPG-09, 13, OPF-20, OPA-17, 05, 06, OPO-03 and B-19.

Les résultats obtenues révèlent que huit amorces sur neuf ont produit des bandes polymorphes, au totale 557 bandes ont été amplifié par l’ensemble des amorces utilisées, le nombre de bandes polymorphes est de 22 bandes sur 557, l’amorce OPA-13 a produit le taux le plus élevé de polymorphisme avec un pourcentages de 11.11% et des bandes de taille qui varie entre 300 et 700pb , suivit par l’amorce OPA-17 avec 6.25% taux de polymorphisme et des bandes de tailles 300 et 500pb et OPF-20 avec 5% de polymorphismes et des bandes de tailles 100 et 750 pb, les amorces OPO-03, OPO-05 et OPC-05 ont produit respectivement (4.64%, 4.54% et 4.45%) de polymorphisme avec des bandes de taille entre 300 et 1500 pb. Les amorces OPG-09 et OPO-06 représentent des amorces avec un faible taux de polymorphisme. (Tableau.25). la présence de polymorphisme est l’indicateur principale de variation somaclonale, différent travaux de recherches se sont basés sur l’analyse du taux de polymorphisme afin de mettre en évidence la présence de variations somaclonales, Nos résultats concordent avec les résultats obtenues par l Mahmood et al.,2012 ; Nimisha et al.,2012 ; Balkrishna et al., 2013 ;Joshi et al.,2013 ;Khoddamzadeh et al.,2013 ;Pathak et al., 2013 .

Code Primer Sequence (5’-3’) Totale des

bandes amplifiées Bands polymorph Polymorphisme (%) OPC-05 GATGACCGCC 128 2 4.54 OPG-09 CTGACGTCAC 89 1 1.12 OPE-13 CCCGATTCGG 72 8 11.11 OPF-20 GGTCTAGAGG 80 4 5 OPA-17 GACCGCTTGT 32 2 6.25 OPO-05 CCCAGTCACT 44 2 4.54 OPO-06 CCACGGGAAG 69 1 1.44 OPO-03 CTGATACGCC 43 2 4.64 B-19 ACCCCCGAAG / / / total 557 22 /

Chapitre IV : Mise En Evidence De La Variation Somaclonale Par Marqueurs

Moléculaires

95

Il a été démontré que la présence d’une variation somaclonale est le résultat d’une altération de nucléotide sur les sites d’hybridation des amorces ou bien par une insertion ou délitions sur le fragment amplifié qui se traduisent par la suite par une observation présence ou absence de produits d’amplification des différents loci (Tingey et al.,1993 ; Pathak et al., 2013).

L’observation des présents profils nous révèle que les régions d’amplification sont différentes d’une amorce à une autre, et pour chaque amorce des différences entre les régions d’amplification sont enregistrées, chaque amorce produit un nombre de bandes amplifiées différents. La comparaison entre l’amplification des bandes issues des plantes cultivées in vitro et in vivo, met en évidence la présence de différences d’amplification, en effet des travaux réalisés par Pathak et al., 2013 ont révélé que des plantes régénérés

in vitro et in vivo donnent des produits d’amplification différents. Les mêmes résultats ont

été observés dans notre cas d’étude. L’Amorce OPC-05 révèle la déférence de produits d’amplifications entre les plantes cultivées in vitro et ex vitro ; la présence d’une bande d’une tailles de 347pb sur le produit d’amplification du puit n° 4 (Waha témoin cultivé ex-vitro en absence de NaCl) et son absence sur les 3 premiers puits de la même variété mais régénéré in vitro sous d’autres conditions révèlent des différences de séquences. Ainsi que d’autres différences de séquences entre les plantes cultivées in vitro et ex vitro sont révélés par les amorces : OPE-13, OPF-20, OPG-09. Ces différences de séquences sont expliquées par l’induction de variation somaclonales par la culture in vitro, car, la culture cellulaire est l’un des facteur inducteur de variation somaclonales (Duncan, 1997 ; Jain, 2001 ; Cassells

et al., 2001 ; Sahijram et al. 2003; Bairu et al. 2011 ; Nimisha et al.,2012 ; Sheeba.,2014 )

Des différences de séquences ont aussi été enregistrées entre les produits d’amplification obtenue en présence et en absence de stress, lors de la comparaison et de l’analyse de l’ADN des plantes régénérées en absence (plantes témoins in vitro et in vivo) et en présence de 16 g/l de NaCl (in vitro et in vivo) l’amorce OPC-05 et l’amorce OPG-09 révèlent toutes deux la présence de différence de séquence entre les plantes régénérées en absence et présence de stress, en effet l’exposition des plantes pendant la régénération induit des changement de séquence exprimées par le développement de variations somaclonales, ces variation sont dues à la capacité de la cellule de développées un mécanisme spécifique qui lui permet de surmonter les contraintes présentent lors de la culture. L’analyse du profil RAPD de l’amorce OPC-05 indique la présence de différences

Chapitre IV : Mise En Evidence De La Variation Somaclonale Par Marqueurs

Moléculaires

96

de séquences entre les plantes témoins et stressés, le puit n°11 représente l’amplification de l’ADN de la variété Adnan-2 régénérée in vitro en présence de 16g/l de NaCl, en comparant les bandes de ce dernier avec le puit n° 13 qui représente les plantes témoins, on remarque l’absence d’une bande sur le puit n°11, cela est un indicateur de variations entres les témoin et les stressés. La même observation est enregistré sur le puit n° 6 du profil de l’amorce OPG-09, dans ce cas, la variété concernée est la variété Beliouni, cette dernière enregistre une différence de séquence en présentant une absence de bande sur le puit de l’ADN obtenus à partir des plantes régénérées en présence de NaCl. Ces variations dues à l’application d’un stress sévère a été largement démontré par différents travaux tels que les travaux réalisées par Balkrishna et al., 2013.

La comparaison de la présence ou absence de bandes entre les six différentes variétés nous révèle aussi la différence de comportement des six génotypes, chaque génotype répond différemment à l’induction de la variation somaclonale. La comparaison de plantes stressées régénérées in vitro montre la présence de différences de séquence, cette information est obtenue par l’amplification en présence de l’amorce OPO-13.les puits concerné sont les : n° 2 (Waha: acclimatation après régénération in vitro), puit n° 3 (Waha régénéré in vitro), puit n° 6 (Beliouni régénéré in vitro), puit n° 9 (Gumgum Rkhem régénéré in vitro), puit n° 11( Adnan-2 régénérés in vitro) et le puit n° 16 (Adnan-1 régénéré in vitro). La différence de séquences entre les six génotypes est noté par l’absence de la bande de la taille ( 549 pb) chez la variété Beliouni et Gemgum Rkhem, et sa présence chez les variétés restantes. Les mêmes résultats ont été obtenue par (Sheeba et al.,2014 Ergül et al.,2015 ).

IV. Conclusion :

La révélation de présence de polymorphisme par une RAPD représente la mise en évidence de la présence de variation somaclonales. Ces dernières sont présentes avec des taux de distribution hétérogènes. Les profils électrophorétiques nous confirment que ces variations sont révélées à travers la comparaison entre l’ADN génomique issue des plantes régénérées in vitro, et in vivo, la comparaison avec les deux différents modes de culture nous confirme aussi que la régénération par embryogénèse somatique est un moyen efficace pour l’obtention de variations somaclonales et cela chez les six génotypes utilisés. Ainsi , l’analyse des profils nous indique sur la capacité de l’agent sélectif de produire les

Chapitre IV : Mise En Evidence De La Variation Somaclonale Par Marqueurs

Moléculaires

97

variations somaclonales, le présent cas d’études nous indique qu’une concentration égale à 16 g/l est une concentration inductrice de variations. L’influence du génotype sur le développement des variations somaclonales a été aussi démontrés par la révélation de polymorphisme par RAPD, ces résultats nous confirment les résultats obtenues lors des précédents chapitres ; le facteur génotypes est très importants lors de la sélection par régénération in vitro. Donc la principale conclusion de ce chapitre c’est que des variations somaclonales ont été induites lors de la régénération in vitro chez les six génotypes de blé dur, cependant ces variations peuvent avoir différentes causes, elles peuvent être dues aux multiples cycles de cultures, à l’application d’un stress sévère lors de la régénération ou bien l’effet génotype qui se traduit par la différence de réponses par rapport à la culture in