B. Application du stress salin par addition direct de différentes concentrations de NaCl lors de la phase d’induction de la callogénèse :
i. Principe général:
Lors de cet essai, l’application de différentes concentrations de stress salin induit par le NaCl a été appliqué directement lors de l’induction de la callogénèse. L’addition du NaCl était établie lors de la préparation du milieu d’induction de la callogénèse ; pour se faire trois différents milieux ont été réalisés (Tableau.15) :
Tableau. 15: Composition des milieux de culture pour l’induction de l’embryogénèse
somatique en présence de différents niveaux de stress salin.
Composition des milieux de culture
MS1 (MS+ 3.5 mg/l 2.4-D)
MS 2 (MS+ 3.5 mg/l 2.4-D+ 4g/l NaCl)
MS 3 (MS+ 3.5 mg/l 2.4-D+ 16g/l NaCl).
Le renouvellement du milieu de culture est réalisé chaque 4 semaines. Quatre repiquages sont réalisés. La culture est maintenue durant 16 semaines afin de mettre en évidence l’effet des différentes concentrations du NaCl sur l’induction de la callogénèse, l’obtention d’embryon somatique ainsi que la régénération de nouvelles plantules après l’application des différentes concentrations de NaCl. Ainsi, le même nombre d’embryons matures a été utilisé, soit 756 portions de cals d’embryons matures, dont 126 cals par variétés. Ce nombre de répétions a été réalisé en trois essais.
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Après la sélection des cals par apport aux différentes concentrations de NaCl utilisées, les cals embryogénes obtenus sont transférés sur le milieu de régénération sélectionné lors du chapitre précédent ; (MS+2mg/l AIA+1mg/l Kinétine. (8 semaines de culture)-Subculture : MS/2+ 1mg/l Kinétine (4 semaines de cultures)) (Ayolié et al.,2011). Après cette étape une étape d’acclimatation est nécessaire pour la régénération complète des plantes et de futures études.
• Acclimatations des plantes régénérées in vitro :
Cette étape est indispensable pour l’étude de l’effet de la régénération in vitro par embryogénèse somatique et l’application de stress lors de cette dernière. Pour se faire, après 4 semaines de culture sur milieu de régénération, les racines des plantules obtenues, sont soigneusement rincées à l’aide d’eaux distillée stérile, afin d’éliminer totalement le milieu de culture, sous des conditions d’asepsie totale, les plantules sont transférées sur des petits pots de culture contenant une mixture de (3v : / 1:v) de terreau et de vermiculite qui sont préalablement stérilisés à l’autoclave pendant 20 min à 120C°, dans des sachets spécifiques. L’acclimatation des plantules doit se faire par un recouvrement par des sachets de polyéthylène transparent, pour le maintien de l’humidité. La culture est maintenue dans une chambre de culture avec une photopériode de 12h de lumière et 8h d’obscurité, à une température égale à 28±2 °C.
ii. Variables mesurées :
Afin de mettre en évidence l’effet du stress salin sur l’induction et le déroulement de la callogénèse ainsi que la régénération in vitro la mesure de certains paramètres est indispensable :
1) Influence de différents niveaux de stress sur l’induction de la callogénèse :
Le taux d’induction de cals sur les différents niveaux de stress induit par le NaCl est calculé suivant la formule :
• é é! (%) = "#$%&' (' )*+, -.(/-0,
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2) Influence de différents niveaux de stress sur la production d’embryons somatiques :
Le taux d’embryons somatique est calculé a partir de cals produits sur les différents niveaux de stress (0, 4, 16g/l de NaCl) grâce à la formule suivante :
• DEFG ! H D I (%) = 123456 :6 @89? 6345J2Ké>6
123456 727896 :6 @89? B>:AB7?× 100
3) Influence de différents niveaux de stress sur le taux de régénération :
L’effet du stress salin sur la régénération in vitro est évalué sur les différents niveaux de stress induit par le NaCl grâce à la formule suivante :
• L ! Fé é éFé ! (%) =123456 :6 =98>76? 5éKé>é5é6?
123456 727896 :6 @89? B>:AB7? × 100
4) Influence de différents niveaux de stress sur le nombre de plantes régénérées par cal :
Le nombre de plante par cal est réalisé par le recensement de plantes produites par cals induits sur les différents niveaux de stress.
3. Etude Statistique :
Une analyse de variance (ANOVA) a été effectuée pour chaque variable en utilisant le logiciel XLSTAT version 2010. Les moyennes des variables mesurées ont été groupées par le Test de NEWMAN-KEULS, au seuil de probabilité de 5%.
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III. Résultats et discussion
A. Application du stress salin par addition successives de différentes
concentrations progressives de NaCl :
1) Détermination de la croissance des cals (TC) :
Après plusieurs semaines de culture et surtout lors du début de l’application du stress progressif, différents changements sont observés sur le développement de la callogénèse ; le premier aspect remarqué est la variation de la couleur des cals ; en effet cette variation est due à l’induction de stress. Différents travaux se sont concentrés sur cet aspect de réponse, une couleur de cal brunâtre (brun) est une réponse négative du stress, (Rochdi et al.,2003 ; Yacoubi et al.,2009). Cela implique que les variétés dont sont issues ces derniers, ont du mal à s’adapter au stress (cals sensibles). Par contre les cals d’une couleur jaunâtre (jaune pâle) sont les résultats des cals tolérants aux différents niveaux de stress, donc les variétés dont elles sont issues sont des variétés tolérantes au stress (Figure.16).
Un deuxième aspect est inséparable de l’aspect couleur, c’est la taille des cals. en effet, la taille des cals brunâtres sont de petites tailles, par contre les cals jaunâtre possèdent une taille supérieure. Donc la taille des cals est représentative de l’effet du NaCl sur le développement de la callogénèse.
Dans cette étude trois essais en parallèle (chaque essai est considéré comme répétition), ont été réalisés afin de déterminer la croissance des cals chez des cals témoins et stressés. Les résultats sont estimés et notés comme suit :
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Tableau. 16: Moyennes et groupes homogènes du taux de Croissance (TC) en présence et
absence de stress progressif chez les six variétés de blé dur.
*(a,b…) indice de séparation des groupes homogènes par le test de NEWMAN-KEULS au seuil α=5%.n=3.
Figure. 15: Taux de croissance (TC) des cals issues des six variétés de blé dur en présence
et absence d’un stress progressif de NaCl.