Résultats et discussion

Purification du Fab à partir d’un lot d’anticorps polyclonaux anti-SY12 de lapin. J’ai mis au point la purification des Fab à partir des lots d’anticorps fournis par nos collaborateurs de Lyon. L’échantillon contient une concentration en SAB aussi forte que celle de l’anticorps (1 mg/ml) comme le montre l’étoile sur la Figure 46a. Malheureusement cela ne permet pas de réaliser une étude en MET. La présence de contaminants en trop grande concentration entraîne beaucoup de bruits dans le fond de l’image et donne une reconstruction 3D finale très bruitée. Il faut donc en premier lieu éliminer la SAB. Pour cela, j’ai réalisé une première étape de purification par affinité sur résine de protéine A. L’anticorps fixé sur la résine est élué indépendamment des contaminants (Figure 46b, Avt). Après cette première étape, il reste encore de la SAB dans l’échantillon mais faiblement par rapport à la concentration en anticorps ce qui ne gène pas pour réaliser une étude en MET. Par la suite, l’anticorps subit une digestion à la papaïne. La coupure des chaînes lourdes a libéré deux fragments d’environ 25 kDa chacun. On peut voir le résultat de la digestion sur la Figure 46 (Après Papaïne). Deux bandes de taille différentes apparaissent entre 25 et 30 kDa alors que la bande de la chaîne lourde à 50 kDa a presque entièrement disparue. La présence d’une bande surnuméraire après digestion à la papaïne d’une taille inférieure à 15 kDa correspond la digestion en deux parties du fragment Fc (Figure 46). En effet lorsque la digestion à la papaïne est trop longue, il se produit un clivage supplémentaire à environ la moitié du Fc. Ce clivage entraîne l’apparition d’un demi-fragment Fc qui se lie à la protéine A et de la 2ème partie qui a perdu sa capacité d’attachement avec la protéine A. La coupure du fragment Fc en deux parties explique pourquoi l’intensité de la bande du Fc est plus faible que celle du Fab sur la piste R, Après Papaïne de la Figure 46b.

La purification des fragments Fab après coupure à la papaïne est réalisée par une 2ème étape d’affinité pour la protéine A. Cette étape a permis de séparer les fragments Fab des Fc comme on peut le voir sur les pistes Fab et Fc de la Figure 46. Les bandes correspondantes aux parties d’anticorps ne sont pas nettes sur le gel. Ces bandes sont assez étendues, laissent des « trainées » ou traces sur le gel certainement à cause de la glycosylation des chaînes lourdes et légères d’anticorps. La glycosylation d’une protéine entraine la présence de plusieurs formes de la protéine en solution avec des poids moléculaires différents.

Figure 46: Gels 12% Tris-Tricine en conditions dénaturantes de contrôle en cours de purification.

M = Marqueur de poids moléculaire, le poids correspondant à chaque bande est marqué sur le coté gauche du gel, les valeurs de masse moléculaires sont exprimées en kDa. (a) Anticorps anti-SY12 : * = SAB ; ! = chaînes lourdes d’Ig G ; ! = chaînes légères d’Ig G. (b) Avt = Anticorps à la sortie de la 1ère colonne de protéine A. Après papaïne : Echantillon après la digestion à la papaïne. Après digestion à la papaïne, Fab : Fraction non retenue après une 2eme étape de purification sur protéine A. Fc : Fraction éluée après une 2eme étape de purification sur protéine A. La flèche indique la bande surnuméraire après digestion à la papaïne. NR = conditions non réductrices, R = conditions réductrices.

Ceci a pour conséquence la présence, sur un gel dénaturant, d’une série de bandes très proches au niveau de la bande majoritaire laissant ainsi un effet de « trainées » sur le gel. La 2ème étape de purification ne permet malheureusement pas d’éliminer une partie du Fc puisque celui-ci est clivé en deux parties dont une qui n’a pas d’affinité pour la protéine A. A la fin de la purification l’échantillon de Fab obtenu reste suffisamment pur pour ne pas gêner l’observation et la formation des complexes Fab avec le virus entier HAdV-5_SY12. Afin de vérifier si l’anticorps n’est pas dénaturé, j’ai déposé en parallèle le même échantillon en conditions réductrices et non réductrices.

Figure 47: Gel 12% Tris-Tricine en conditions dénaturantes de contrôle en fin de purification.

R correspond à l’échantillon purifié déposé en présence d’un agent réducteur le β- mercaptoethanol alors que les 3 pistes suivantes ont été déposées sur le gel en absence de cet agent réducteur. Fab : Fraction non retenue sur la protéine A. Fc : Fraction éluée de la protéine A. La flèche indique la bande surnuméraire observée après digestion à la papaïne. NR = conditions non réductrices, R = conditions réductrices.

En conditions réductrices, les ponts disulfures sont réduits et les différentes chaînes d’anticorps sont individualisées. En conditions non réductrices, les différentes chaînes sont dénaturées mais restent attachées par les ponts disulfures qui les relient. On peut voir que le Fab existe sous sa forme non réduite seulement après la concentration finale de l’échantillon. En effet, le tampon de digestion pour la papaïne contient 20 mM cystéine réduite. La présence de la cystéine entraîne la réduction de l’anticorps. En solution, il n’existe plus que la forme oxydée de la molécule comme on peut le voir sur la Figure 47. Après la concentration, la cystéine initialement présente passe à travers la membrane du concentrateur et est ainsi séparée des fragments Fab. Après concentration, on peut voir apparaître sur le gel une bande, entre 40 et 50 kDa, correspondant au Fab oxydé.

Le modèle 3D du virus HAdV-5_SY12. Le modèle a été calculé à partir de 18 micrographies sur lesquelles ont pu être sélectionné un total de 4905 particules dont 60% (2943) ont servi à calculer une reconstruction 3D finale d’environ 13 Å de résolution à FSC0,5 (cf. FSC en Annexe 4). Le modèle 3D calculé semble complet (Figure 48). Toutes les protéines majeures sont présentes au sein de la capside. Les Pentons sous forme entière sont observés au niveau des sommets et les Hexons forment bien le reste de la capside (Figure 48). Ceci renseigne sur la qualité de l’échantillon viral utilisé pour réaliser la CryoME. Cet échantillon semble avoir bien supporté la congélation et était intact au moment de sa préparation pour la ME. En termes de protéines mineures externes, ce virus mutant semble posséder toutes les caractéristiques structurales d’un HAdV-5 WT. La position des protéines mineures externes semble conservée. On observe bien, à sa surface, les densités précédemment attribuées aux protéines IX et IIIA (Figure 48).

Figure 48: Vue de dessus d'une face de la Reconstruction 3D obtenue pour le HAdV-5_SY12.

Les Pentons sont colorés en Bleu. On voit les densités précédemment attribuées aux protéines IX en jaune et IIIa en rose. Les axes de symétrie d’ordre 2 sont indiqués par des ellipses jaunes.

On note tout de même une différence au niveau de la reconstruction calculée par rapport à celle obtenue à haute résolution du HAdV-5 WT. En effet, les boucles flexibles situées au sommet des Hexons sont beaucoup plus détaillées dans la nouvelle reconstruction (Zone entourée sur la Figure 49a et b). Un niveau de détail important est aussi visible pour le Penton où l’on remarque clairement les zones de contact entre la Base et la Fibre. L’utilisation d’un microscope FEG dans cette étude montre clairement la qualité des images ainsi que l’importance de l’utilisation d’une source plus cohérente. Pour une résolution plus faible, l’utilisation d’un microscope FEG nous a permis de visualiser plus de détails que dans la reconstruction à 9 Å que nous avions obtenue pour le HAdV-5 WT.

De plus, on remarque du côté externe de la capside une différence majeure au niveau de la densité précédemment attribuée à la protéine IIIa. Cette densité semble légèrement plus longue et plus étoffée au niveau des extrémités. Elle ne possède pas la même inclinaison que celle du virus WT (Figure 49). Il est difficile de quantifier ce changement d’orientation mais celui-ci est tout de même notable sur une vue de dessus de la capside (Figure 49).

Figure 49: Comparaison des densités attribuées à la protéine IIIa entre le virus WT et SY12.

(a) Densité attribuée à la protéine IIIa dans la reconstruction du HAdV-5 WT en rose (cf. Article 1). (b) Même densité dans la reconstruction du HAdV-5_SY12, en rose. L’ellipse jaune marque la position d’un axe icosaédrique d’ordre 2. Le cercle montre une boucle flexible, du coté externe de l’Hexon. On remarque aussi sur les deux figures la position de l’extrémité N terminale de la protéine IX en jaune.

Chez le virus WT, la densité est orientée de façon verticale et réalise un contact avec la partie basse des Hexons du coté gauche et du coté droit. La protéine est assez allongée et possède des extrémités internes et externes plus fines que sa partie intermédiaire. Chez le virus mutant HAdV-5_SY12, la protéine est orientée de façon plus horizontale. Ceci a pour conséquence l’absence de contacts avec la partie basse des deux Hexons qui l’encadrent. En effet, la zone la plus interne de contact avec les Hexons observée dans la capside du virus WT n’existe plus chez ce virus mutant. La densité forme maintenant un cylindre où les extrémités sont de même largeur que la zone intermédiaire.

Nous n’avons pas détecté de modifications même mineures de la densité précédemment attribuée à la protéine IX (en jaune sur la Figure 48). La seule modification externe de la capside observée se situe au niveau de la densité précédemment attribuée à la protéine IIIa. Cette observation vient confirmer ce qui a été observée par Saban et collaborateurs en 2006 (Saban et al., 2006). Les auteurs ont attribué la densité de la protéine IIIa à l’extrémité C terminale de la protéine IX. En effet, les auteurs arrivent à replacer dans cette densité jusqu’à quatre hélices alpha correspondant aux extrémités C-terminale de quatre protéines IX. Les données que nous avons obtenues semblent confirmer cette observation. La seule modification protéique existante entre le virus WT et la souche SY12 est l’addition d’un peptide de 12 acides aminés attachés directement à l’extrémité C terminale de la protéine IX. La présence de ce peptide viendrait donc modifier les contacts que la protéine IX peut réaliser avec les Hexons adjacents. Les 2 extrémités de la densité rose (Figure 49) sont modifiées dans notre reconstruction ce qui laisse à penser qu’au moins un peptide de 12 acides aminés est présent au niveau de chaque extrémité. On peut donc dire que la densité est composée d’au moins deux extrémités C terminale positionnées en tête bêche. Cela confirme que la région en jaune (Figure 48) ne constituerait que les extrémités N terminales de la protéine. Cette modification de localisation de la protéine IX explique aussi l’absence totale de densités externes que nous avions observées au niveau de la capside du virus HAdV-5 où le gène de la protéine IX avait été supprimé. Cette hypothèse semble plus simple que celle proposée en 2005 (Article 1) où la protéine IIIa se serait détachée après déstabilisation de la capside en absence de protéine IX. Nous avons voulu néanmoins réaliser un marquage anticorps au niveau du peptide SY12 afin de confirmer les résultats obtenus.

Le modèle 3D du virus HAdV-5_SY12 en complexe avec un Fab anti-SY12. 11 micrographies de bonne qualité (sans astigmatisme, ni dérive) ont permis de réaliser la sélection manuelle de 2548 particules dont 949 ont permis de calculer une reconstruction 3D à 22 Å de résolution (FSC0,5) du virus HAdV-5_SY12 en complexe avec le fragment de Fab anti-SY12. J’ai volontairement choisi de me placer à FSC0,5 car la courbe ne permet de déterminer de façon précise la résolution à FSC0,3 (Annexe 4). Avec 949 particules et l’utilisation d’un microscope FEG, nous pensions obtenir une reconstruction 3D à une résolution un peu plus importante. La présence des fragments Fab attachés à la surface du virus est responsable d’une augmentation du bruit autour des capsides dans les images. Ce phénomène accroit la difficulté à orienter les particules correctement à l’aide du

programme PFT. Nous avons donc utilisé assez rapidement PFT2 pour orienter les particules ce qui nous a permis d’obtenir un modèle 3D à moyenne résolution. Le modèle 3D calculé pour le virus en complexe avec le Fab semble complet. Toutes les protéines majeures sont présentes dans la capside. Les Pentons sous forme complète sont observés au niveau des sommets et les Hexons forment bien le reste de la capside (Figure 50). La forme globale de la capside est conservée par rapport au contrôle sans marquage anticorps. La partie N terminale de la protéine IX est bien présente au niveau du GON (en jaune sur la Figure 50). Elle forme de la même manière que chez les autres virus humains que nous avons étudiés un triskelion stabilisant les Hexons au sein d’une face.

Figure 50: Comparaison des reconstructions 3D obtenues pour le HAdV-5_SY12 en présence et en absence d'anticorps.

(a) Vue de dessus d’une face de la reconstruction obtenue pour le virus SY12 en complexe avec un Fab anti-SY12. La densité où se fixe le Fab est colorée en vert. Si le niveau de contour choisi est le même qu’en b, la densité verte est peu visible. (b) Vue de dessus d’une face de la reconstruction du même virus en absence de marquage par anticorps. Sur les 2 figures, les extrémités N-terminales des protéines IX sont colorées en jaune et les Pentons en bleu.

On peut tout de même remarquer une différence majeure au niveau de la surface du virus. La densité rose observée sur la reconstruction contrôle a disparu. Il est maintenant nécessaire de jouer sur le niveau de contour si l’on veut observer une densité dans cette zone (en vert sur la Figure 50). Lorsqu’on fixe le niveau de contour à une valeur faisant apparaître les densités moins fortes, on observe maintenant une région allongée assez fine qui se prolonge au niveau de ses deux extrémités par une zone large de densité assez diffuse (En vert sur la Figure 50). Au niveau des extrémités, les zones de densité diffuse sembleraient correspondre à l’attachement du Fab au niveau du peptide SY12. La présence des fragments Fab au niveau de l’extrémité C terminale de la protéine IX déstabilisent complètement la densité observée au niveau du virus contrôle. La présence de densités correspondant au Fab au niveau des deux extrémités confirme la présence de peptides SY12 de

chaque coté et donc le placement en tête bèche d’au moins deux extrémités C terminales de protéines IX dans cette zone mais il nous est difficile de conclure définitivement sur le nombre d’extrémités C terminales qui composent la densité précédemment attribuée à la protéine IIIa. La fixation des Fab au niveau du peptide dans cette zone semble entrainer la déstabilisation complète des hélices alpha présentes au niveau de l’extrémité C terminale de la protéine IX. La fixation des Fab provoque aussi une flexibilité importante dans cette région de la capside ne nous permettant pas de visualiser plus précisément l’anticorps à ce niveau. La forme que nous observons pour l’extrémité C terminale de la protéine IX attachée au Fab est le résultat de la moyenne réalisée lors du processus d’analyse d’images et de reconstruction 3D entre des capsides dépourvues d’anticorps et des capsides où l’anticorps est attaché. Ceci a pour conséquence l’apparition d’une densité plus faible possédant en partie la forme et l’orientation de la densité de départ observée dans le virus contrôle. Nous aurions aimé réaliser une étude plus approfondie du contact entre le Fab et le modèle quasi-atomique de la capside entière par « fitting » de la structure quasi-atomique d’un Fab mais nous avons obtenu des résultats convaincants quant à la localisation de l’extrémité C terminale de la protéine IX chez les Adénovirus Humains.

V.3 Conclusion

Après les résultats obtenus concernant la localisation de l’extrémité C terminale de la protéine IX chez l’Adénovirus Canin de type 2, nous avons apporté ici une preuve structurale de sa localisation chez les Adénovirus humains. Nous avons donc isolé et purifié un fragment Fab reconnaissant le peptide SY12 présent à l’extrémité C terminale de la protéine IX chez une souche modifiée de HAdV-5. Nous avons ensuite étudié par CryoME et analyse d’images l’échantillon viral en absence et en présence de Fab à sa surface. Cette technique nous a permis de reconstituer un modèle 3D de la capside en absence et en présence du fragment Fab à sa surface. L’analyse de ces deux modèles permet de conclure définitivement quant à la localisation d’au moins deux extrémités C terminales de protéines IX positionnées en tête bèche au niveau des densités qui avait été précédemment attribuée à la protéine IIIa. La présence des extrémités C terminales de la protéine IX au niveau de la densité attribuée à la protéine IIIa avait été introduite par Saban et collaborateurs en 2006. Notre étude structurale conforte l’hypothèse avancée par Saban et collaborateurs où la densité attribuée à la protéine IIIa ne serait donc qu’une partie de la protéine IX mais celle-ci ne nous permet pas de conclure définitivement sur le nombre de protéines IX qui composent cette densité.

VI. Etude structurale d’un mutant immature de l’Adénovirus Humain de type 2