Matériel et Méthodes

III. 1.1Purification du virus CELO

Nous disposions de deux échantillons différents de virus CELO. Le premier provient d’une collaboration avec le Dr. Matthew Cotten (Axxima Pharmaceuticals, Allemagne). Le virus CELO, après purification sur gradient de Chlorure de Césium (CsCl), nous a été envoyé à -80°C dans une solution de conservation contenant 40% de glycérol. La présence du glycérol et de CsCl dans le tampon de congélation du virus ne permet pas de réaliser directement une étude en CryoME. Cet échantillon doit subir une étape de purification afin d’éliminer le glycérol. Le deuxième lot de virus provient d’une collaboration avec le Dr Patrick Langlois de l’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments à Ploufragan (AFSSA). Ce lot est produit sur une lignée cellulaire LMH d’hépatocarcinomes de poulet (Leghorn Male Hepatoma) jusqu’à lyse complète des cellules. Le virus est ensuite récolté dans le milieu de culture et envoyé à 4°C. Dans ce cas, il est nécessaire de purifier le virus des contaminants du milieu de culture avant des études en CryoME. J’ai donc mis au point un protocole de purification du virus à partir du milieu de culture.

Précipitation au Sulfate d’Ammonium. Cette étape n’est réalisée que sur le deuxième échantillon de CELO car elle permet d’éliminer une grande partie des contaminants du milieu de culture cellulaire dont la Sérum Albumine Bovine (SAB). Une précipitation au sulfate d’ammonium, adaptée des travaux de Schagen et collaborateurs (Schagen et al., 2000), est réalisée sur le milieu de culture. Le milieu est incubé de façon croissante jusqu'à 40 % de saturation en sulfate d’ammonium, 2h30 sous agitation à température ambiante. Dans ce cas, la protéine SAB, contaminant majeur du milieu de culture, reste soluble alors que le virus précipite. Le précipité contenant le virus est en suite culoté par centrifugation à température ambiante pendant 15 min à 1600 g. Le culot est recouvert par 1/40ème du volume de départ en PBS 1x, et stockée à 4° C. De cette manière, le précipité se resuspend lentement ce qui évite d’endommager le virus.

Gradient de Chlorure de Césium. Cette étape est réalisée pour les 2 types d’échantillons pour éliminer le glycérol ou terminer la purification du CELO après la précipitation. Le surnageant de l’étape précédente ou la solution de virus du Dr. Cotten est déposé au dessus d’un gradient de densité en CsCl formé de deux couches : une couche inférieure à une concentration de 4 M CsCl et une couche supérieure à 2,2 M dans un tampon 10 mM tris pH 7,5. Le gradient est ultracentrifugé à 210000 g pendant 12h dans une ultracentrifugeuse Beckman-Coulter munie d’un rotor SW41 ou SW55 en fonction du volume à centrifuger. Cette méthode est adaptée des travaux de Kanegae et collaborateurs (Kanegae et al., 1994). Après centrifugation, le virus intact se situe à l’interface entre les 2 couches de CsCl (Figure 39a). Le virus étant dense, il forme donc une bande concentrée opalescente juste au dessus de la deuxième couche. Il est récolté par ponction à l’aide d’une seringue au niveau de cette bande. Le gradient contient plusieurs autres bandes contaminantes qui migrent à une densité plus faible dans le gradient.

Désalage et Concentration de la Solution Virale. La dernière étape de la purification constitue le désalage et la concentration de la solution virale. Il est nécessaire de désaler l’échantillon afin d’éliminer la forte concentration de CsCl présente qui ne permet pas de réaliser une étude en CryoME car elle entraîne une perte complète de contraste en CryoME. J’ai utilisé plusieurs méthodes de désalage sans réel succès. J’ai tout d’abord réalisé une dialyse classique dans un tampon tris 10 mM pH 7,5 mais cette technique trop rapide provoque un éclatement des particules virales. J’ai par la suite réalisé une dialyse progressive dans un bain de 600 ml d’un tampon 10 mM Tris pH 7,5 contenant 3 M NaCl pour compenser la dilution du CsCl. Dans ce bain est ajouté environ 3 l de

tampon Tris 10 mM pH 7,5 à une vitesse de 2 ml/min, à l’aide d’une pompe péristaltique. Lors de l’ajout, la solution de dialyse est homogénéisée par agitation magnétique. Cette méthode permet de diluer progressivement le CsCl ainsi que le NaCl sans entraîner de choc osmotique pour le virus. Cette dialyse se termine par deux bains de 1 l de tampon Tris pH 7,5 150 mM NaCl. Cette étape de désalage est vraiment déterminante pour la qualité finale de l’échantillon. En effet, le virus CELO semble beaucoup moins stable au cours de la dialyse qu’un Adénovirus humain de type 5. Il m’a été difficile même avec la dialyse progressive d’obtenir un échantillon intact en fin de purification. La dialyse progressive a l’inconvénient majeur de diluer fortement l’échantillon. Il est donc nécessaire de concentrer le virus avant d’observer le virus en CryoME. J’ai donc essayé plusieurs méthodes de concentrations. La première, à l’aide d’un concentrateur, n’a pas donné de bons résultats. Le virus même à faible vitesse est détruit au cours de la concentration. Par la suite, j’ai utilisé une cassette d’absorption Vivapore5 (Vivascience) munie d’une membrane en cellulose régénérée (c/o = 30kDa). Cette méthode, beaucoup plus longue, ne détruit pas le virus mais une grande quantité d’échantillon est perdue au cours de cette étape. Je discuterai de la purification complète de ce virus ainsi que de sa stabilité dans la partie Résultats et Discussion. Apres concentration, la solution virale est conservée à température ambiante plutôt qu’à 4°C pour prévenir de l’agrégation du virus.

III. 1.2La microscopie électronique et l’analyse d’images

La solution concentrée de virus est tout d’abord observée en coloration négative dans 2% AmMb afin de vérifier l’intégrité des capsides avant congélation. Les contrôles sont réalisés sur le MET microscope JEOL 1210-EX de l’EMBL à un grandissement nominal de 40 000 fois. Ce contrôle permet également d’évaluer sa concentration.

La concentration en virus étant trop faible pour permettre la congélation sur une grille à trous classique, le virus est préparé pour la cryoME sur une grille Quantifoil recouverte d’une couche de carbone, de la même façon que le HAdV-5 pIX° (cf. II.2.2).

La prise d’images est réalisée de la même manière que pour tous les échantillons d’HAdV-5, sur un MET Philips CM200 à un grandissement calibré de 28 600 fois. Les négatifs sélectionnés ont été numérisés à un pas de 14 μm ce qui correspond à une taille réel de pixel de 5,1 Å. La sélection manuelle des particules est réalisée dans X3D dans une boite de 243 pixels de coté. La correction de CTF est réalisée jusqu’à 20 Å de résolution. Les images flippées et déconvoluées sont utilisées dans PFT et EM3DR pour calculer une reconstruction 3D de la capside du CELO en utilisant la

reconstruction 3D de l’HAdV-5 à 10 Å de résolution comme modèle de départ. Nous avons ensuite continué l’analyse des images avec PFT2 et EM3DR2 en espérant améliorer la qualité de la reconstruction finale.

III. 1.3Le fitting

J’ai utilisé le programme URO (Navaza et al., 2002) afin de reconstituer un modèle quasi-atomique de la capside du CELO en recalant la structure de l’Hexon du HAdV-5 dans la reconstruction 3D que nous avions obtenu. Pour cela, j’ai manuellement replacé les 4 Hexons de l’UA dans la reconstruction avec « O » puis j’ai utilisé URO en combinaison avec les matrices de rotation icosaédriques pour améliorer mon placement manuel (Jones et al., 1991). Le recherche de la position optimale dans URO a été réalisé jusqu’à une résolution de 30 Å. En 2007, la structure de l’Hexon du CELO a été publiée à 4 Å de résolution (Xu et al., 2007). J’ai donc essayé à la fin de ma thèse de recaler cette structure au sein de la reconstruction 3D que nous avions obtenu, de la même manière qu’avec la structure de l’Hexon du HAdV-5.