Une analyse plus fine des interactions des segments TM a été réalisée en complément des résultats présentés dans l'article. L'interaction des hélices TM est souvent médiée par les motifs GxxxG ou de type GxxxG (une glycine ou les deux sont remplacées par des petits résidus tels que les résidus alanine et sérine) (Cymer et al., 2012; Kleiger et al., 2002; Lemmon et al., 1992; Moore et al., 2008; Russ et Engelman, 1999; Senes et al., 2000, 2004). Les interactions via GxxxG sont renforcées, de part et d'autre de ce motif, par des résidus dont la chaine latérale est branchée au carbone β (L, V et I) et par de petits résidus (A, G, S). La position de ces résidus est très importante pour la stabilisation de l'interaction. Pour la GpA, le motif complet de dimérisation LIxxGVxxGVxxT a été identifié (Melnyk et al., 2004).
Le segment TM de NccX, composé de 21 résidus, contient 11 résidus dont la chaine latérale est branchée au carbone β et 7 petits résidus. Afin d'identifier des résidus potentiellement importants pour l'interaction des segments TM, des simulations ont été effectuées à partir de NccX-TMsim, par Norbert Garnier. Quatre simulations indépendantes ont été considérées comme représentatives de l’ensemble. Elles ont données des résultats différents, illustrant la liberté d’interaction de ce système (NccX-TMsim). Par ailleurs, chaque simulation révèle que les hélices TM de NccX-TMsim interagissent de manière dynamique. En effet, lorsque deux modèles d'hélices NccX-TMsim sont disposés à 6 nm l'un de l'autre dans une bicouche d’un phospholipide, le POPC (1-Palmitoyl-2-OleoylPhosphatidylCholine), les hélices interagissent quasi instantanément (0,2 μs) (Figure 23A) et de façon dynamique : la distribution des angles de croisement des hélices indique que les hélices se croisent via trois angles majoritaires (Figure 23B). Les hélices TM de NccX-TMsim se croisent principalement via deux angles négatifs (Ω : -35° et -20°) et un angle positif (Ω : +10°). La valeur de ces angles est comparable avec les mesures effectuées dans d'autres protéines TM obtenues par simulations suggérant une topologie similaire des hélices TM (Tableau 3).
Figure 23 : Simulation gros grains de l'interaction des hélices NccX-TMsim. Deux
monomères ont été insérés dans une bicouche de POPC, le long de l'axe Z qui est normal au plan de la bicouche lipidique, à une distance de 6 nm l'un de l'autre. A : Représentation de la distance entre les deux hélices en fonction du temps pour l'une des 4 simulations effectuées. Les hélices viennent au contact l'une de l'autre quasi instantanément (moins de 2 μs).
B : Représentation de la distribution des angles de croisement des hélices de NccX mesurée
pour les 4 simulations effectuées indépendamment.
Tableau 3 : Exemples d'angles de croisement d'hélices TM Protéine Etat oligomérique Angles de
croisement majoritaires (Ω)
Références
Glycophorine A homodimère -25° (Psachoulia et al., 2010)
Syndecan-2 homodimère -30° (Psachoulia et al., 2010)
αIIb/β3 hétérodimère -25° et +28° (Psachoulia et al., 2010)
DAP12 homodimère -35° et +20° (Wei et al., 2014a)
Plexin-A1 homodimère -35°, -33° et +20° (Aci-Sèche et al., 2014)
NccX homodimère -35°, -20° et +10° (Ziani et al., 2014) L'analyse de ces 4 simulations a permis de détecter les paires de résidus (chaque résidu sur
lors de l'homodimérisation de NccX-TMsim. Le tableau 4 représente le bilan des 4 simulations.
Tableau 4 : Liste des paires des résidus dont la distance (entre parenthèse) est la plus courte
pour les principaux angles de croisement formés par les hélices.
Angle de croisement (Ω) Ω = -35° (0,5 - 0,6 nm) Ω = -20° (0,5 - 0,6 nm) Ω = +10° (0,6 - 0,7 nm) G16 G16 G20 G20 A24 A24 G16 L14 G20 L14 G20 L18 M23 L18 G27 L22 G16 S12 G16 V15 V19 V15 M23 V19 M23 L22 V30 V26 V30 Y19 T34 S33
Les résidus V15, G16, V19, G20 et M23 détectés comme importants lors de la première simulation ont été remplacés par une alanine. Leur rôle dans l'homodimérisation de NccX-TMsim a ensuite été testé par TOXCAT. Les activités CAT mesurées pour les mutants V15A, V19A et M23A de NccX-TMsim sont similaires à celle de NccX-TMsim indiquant qu’aucun de ces résidus pris isolément n'est déterminant pour le rapprochement des segments TM de NccX (Figure 24).
Figure 24 : L'homodimérisation de NccX s'effectue principalement par ses domaines
périplasmiques. A : Mesure de l'activité CAT induite par les constructions ToxR-NccX-MBP. Les résidus révélés lors de la première simulation comme importants pour l'homodimérisation ont été mutés en alanines. Seuls les glycines du motif GxxxG semblent être importants pour l'interaction des domaines TM. Les activités CAT sont normalisées par rapport à celle mesurée pour NccX-TMsim. B : Test de complémentation malE pour vérifier la topologie des différentes protéines chimériques. Sur un milieu minimum M9, où le maltose est la seule source carbonée, seules les cellules exprimant la MBP dans le périplasme et donc la chimère correctement orientée survivent. Les protéines chimériques sont correctement orientées et insérées dans la membrane. La topologie des deux chimères contenant NccX a été testée indépendamment par fractionnement cellulaire (Figure 21E). Les résultats indiquent que NccX est correctement orientée dans la membrane.
Par ailleurs, la longueur du segment TM et les résidus qui font la jonction entre ce segment TM, la MBP et ToxR influent sur le niveau d'expression de l'enzyme CAT dans le test TOXCAT (Russ et Engelman, 1999; Wei et al., 2011). Il semble que plus la longueur de l'hélice TM est importante, plus l'activité CAT est importante. Toutefois, cette activité peut être la conséquence d'une forte expression de la protéine chimérique. Il s'agit donc de faire un compromis entre le niveau d'expression de CAT et la production de la protéine chimérique qui sont des paramètres dépendant de la protéine d'intérêt. Nous avons donc mesuré l'activité CAT de la protéine chimérique contenant un segment TM de NccX (NccX-TM, L9-Y29), plus petit que NccX-TMsim (T6-S40). L'activité mesurée pour NccX-TM (normalisée par rapport à la quantité de chimères produites) est plus de deux fois inférieure à celle de NccX-TMsim (Figure 24A). Ce résultat confirme que l'activité CAT est sensible à la longueur du segment TM inséré dans la protéine chimérique TOXCAT et indique que les résidus de part et
Finalement, la longueur de NccX-TMsim est plus adéquate que celle de NccX-TM pour observer des différences d'activités mesurées avec les chimères de mutants de NccX-TMsim et c'est pour cela que nous avons choisi NccX-TMsim comme référence pour l'étude de l'interaction des domaines TM de NccX.
A l'issue des 4 simulations (Tableau 4), d'autres résidus sont apparus comme importants pour l'interaction de NccX-TMsim. Cependant, leur rôle n'a pas été testé in vivo puisque nos résultats indiquent que l'homodimérisation de NccX est majoritairement guidée par le domaine périplasmique.
La description du senseur NccX, de son organisation dans la membrane était l’objectif principal de ce travail. Une fois constatée l’incohérence de la structure cristallographique obtenue en présence de DPC avec celle de CnrXs, déjà connue et déjà validée par des approches physiologiques et biophysiques, une analyse approfondie des structures obtenues et la mise en œuvre de quelques approches expérimentales complémentaires (in vivo et in silico) a permis de trouver un sens à la structure déterminée en présence de DPC et d’appuyer un message de prudence à l’égard des résultats générés en présence de détergent.