B. Caractérisation de l'interaction entre CnrYp et CnrXs
2. Modulation de l'interaction entre CnrYp et CnrXs par les métaux
Rappelons que Cupriavidus metallidurans CH34 est capable de résister au nickel et au cobalt grâce à une pompe d'efflux dont la production est spécifiquement induite en présence d'un excès de nickel, de cobalt ou, dans une moindre mesure, de cuivre. Par ailleurs, du zinc est retrouvé dans la forme inactive de la protéine CnrX. La partie périplasmique du senseur métallique, CnrXs, perçoit l'excès de métaux. La façon dont CnrX alerte CnrY de la présence de métal est encore inconnue. Après avoir montré que les régions périplasmiques de ces deux protéines interagissent, nous avons vérifié l'effet des métaux sur l'interaction entre CnrXs et CnrYp.
Le protocole de coprécipitation a été adapté pour tester l'effet des métaux sur l’interaction entre CnrXs et CnrYp. Les différents sels de métaux lourds ont été ajoutés au lysat clarifié des bactéries surproduisant CnrXs. Le lysat de CnrXs a aussi été utilisé sans métaux en guise de contrôle positif. Après 15 min d'incubation, le lysat en présence ou en absence de métaux est centrifugé afin de sédimenter les éventuels précipités de protéines. Le surnageant de ce lysat est ensuite ajouté aux protéines MYp retenues par les billes d'amylose (amylose:MYp). La quantité de CnrXs présente dans ce surnageant a été vérifiée sur gel SDS-PAGE (Figure 37_2). Par la suite, le protocole est similaire à celui utilisé précédemment.
Tout d'abord, l'expérience a été effectuée avec 2 mM de nickel, de cobalt et de zinc (Figure 37A). Certains métaux tels que le zinc sont connus pour faire précipiter les protéines. Dans notre expérience, la quantité de CnrXs ajoutée aux billes d'amylose est la même quelque soit le métal utilisé (Figure 37A_2). Ainsi, nous pouvons comparer les quantités de CnrXs retenues sur la résine d'amylose.
On détecte une bande, correspondant à CnrXs, d'intensité similaire quel que soit le métal utilisé mais aussi sans métal (Figure 37_1). Cela suggère que ces métaux n'ont aucun effet sur l'interaction entre CnrXs et CnrYp ou que le seuil de sensibilité de CnrXs n'a pas été atteint. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons augmenté la concentration d'ions métalliques à 5 mM (Figure 37B_1). Cette concentration ne précipite pas CnrXs, qui est en quantité comparable quel que soit le métal utilisé (Figure 37B_2). A cette concentration, le signal
qu'il est similaire au contrôle positif lorsque CnrXs est incubé avec du zinc. Les résultats indiquent d'une part que la concentration des métaux réelle disponible pour CnrXs lorqu'ils sont ajoutés au lysat bactérien riche en protéines est surestimée et que le nickel et le cobalt empêchent l'interaction entre CnrXs et CnrYp contrairement au zinc qui ne déstabilise pas l'interaction.
Figure 37 : Effet des métaux sur la coprécipitation de CnrXs avec MYp. Les pistes de gauche (1) correspondent aux protéines retenues sur les billes d'amylose après incubation du lysat de
CnrXs avec soit 2 mM (A) soit 5 mM (B) de nickel sous forme NiSO4 (Ni), de cobalt, CoCl2 (Co) et de zinc, ZnSO4 (Zn). Sur les pistes 0, CnrXs n'est pas incubé avec des métaux (contrôle positif). Les pistes de droite (2) correspondent aux protéines du surnageant de lysat de CnrXs incubé avec les différents métaux.
L'expérience précédente a été renouvelée afin de tester d'autres métaux lourds divalents : le cuivre, le cadmium, le manganèse et le magnésium. Sur la figure 38, nous pouvons observer qu'il n'y a pas de signal correspondant à CnrXs avec le nickel, le cobalt alors qu'une même quantité de protéine CnrXs a été ajoutée aux billes d'amylose:MYp
(Figure 38_2). Aucune bande correspondant à CnrXs n'est détectée avec le cadmium. Cependant, il apparait que le cadmium précipite les protéines (Figure 38_2). Avec le cuivre, le signal est plus faible (environ trois fois) que le contrôle. Des bandes d'intensités similaires au contrôle sont détectées avec le manganèse et le magnésium alors qu'avec le zinc, l'intensité mesurée est environ trois fois plus importante que celle du contrôle (Figure 38).
Figure 38 : Effet des métaux sur la coprécipitation de CnrXs avec MYp. Le panneau (1)
correspond au gel SDS-PAGE sur lequel a été déposé les protéines retenues sur les billes d'amylose, après incubation du lysat de CnrXs avec 5 mM de nickel (NiSO4, Ni), de cobalt (CoCl2, Co), de cuivre (CuSO4, Cu), de zinc (ZnSO4, Zn), de cadmium (CdSO4, Cd), de manganèse (MnSO4, Mn) et de magnésium (MgSO4, Mg). Sur les pistes 0, CnrXs n'est pas incubé avec des métaux (contrôle positif). Le panneau (2) correspond au gel SDS-PAGE sur lequel a été déposé le surnageant de lysat de CnrXs incubé avec les différents métaux, en l'absence de MYp.
Il ressort de ces résultats que l'interaction entre CnrYp et CnrXs est bien modulée de façon spécifique par différents cations métalliques. Les métaux les plus inducteurs de la réponse au stress métallique induite par CnrYXH que sont le nickel et le cobalt ont l'effet le plus marqué sur l'interaction entre CnrXs et CnrYp. Le cuivre, dont le pouvoir d'induction est plus faible que le cobalt et le nickel, déstabilise l'interaction entre CnrXs et CnrYp contrairement au zinc (métal non inducteur) qui la stabilise. Le manganèse et le magnésium ne modifient pas l'interaction entre les deux protéines. Nous ne pouvons pas conclure sur l'effet du cadmium
La conclusion de cette série d'expériences est que l'interaction entre CnrXs et CnrYp est favorisée en présence de zinc et déstabilisée en présence de nickel, de cobalt ou de cuivre. Nous savons que la substitution du zinc par le nickel ou le cobalt au site métallique de CnrX induit des modifications conformationnelles qui déclenchent probablement le processus de signalisation. Que ces changements de conformation affectent l'interaction entre les domaines périplasmiques de CnrX et CnrY est une hypothèse séduisante, dans la perspective de la transmission d’un signal de CnrX à CnrY.