Efflux  des  ions  métalliques

a. Systèmes d'efflux de la membrane interne

L'export des métaux du cytoplasme vers le périplasme est assuré par différents types de transporteurs :

- Les ATPases de type PIB constituent un sous-groupe de la superfamille des ATPases de type P dédié au transport des métaux à travers la membrane cytoplasmique (Argüello et al., 2007; Nies, 2003). Ce transport nécessite de l'énergie qui est fournie par l'hydrolyse de l'ATP. Ces protéines se composent de 6 à 10 domaines TM, d'une boucle A (Actionneur) et de deux domaines de liaison à l'ATP (N pour "Nucleotide-binding" et P pour "Phosphorylation") cytosoliques (Figure 15). Le mécanisme d'action est similaire à celui des ATPases de type P (Palmgren et Nissen, 2011). La fixation de l'ATP sur le domaine N et de l'ion métallique sur la protéine entraine la phosphorylation de l'aspartate conservé situé sur la boucle cytoplasmique reliant les hélices TM 6 et 7 (domaine P). Cette phosphorylation induit un changement conformationnel qui permet le transfert du métal vers le périplasme. Une des ATPases de type PIB la mieux caractérisée est la protéine CadA de Staphylococcus aureus. Elle permet la résistance aux ions cadmium mais aussi aux ions cobalt et zinc (Tsai et al., 2002). Huit protéines de ce type sont présentes chez C. metallidurans CH34 contre environ 2 ou 3 chez les autres bactéries dont le génome a été séquencé (2 chez E. coli, 3 chez B. subtilis,

Figure 15 : Topologie du transporteur ATPases de type PIB. Les domaines TM H1 à H8 sont indiqués. La position des domaines cytoplasmiques A, P et N est indiquée. Les résidus conservés (sphères bleues) dans les hélices H6, H7 et H8 forment le site métallique au niveau TM. Les domaines de liaison aux métaux au niveau des extrémités N-termitale et C-terminale sont représentés par des rectangles jaune et rouge (Argüello et al., 2007).

- Les protéines CDF pour "Cation Diffusion Facilitators" forment une famille de transporteurs métalliques. Leurs substrats sont le zinc, le cobalt, le nickel, le cadmium et le fer. Leur transport s'effectue grâce à la force protomotrice de la membrane cytoplasmique (Nies, 2003). Parmi les pompes de ce type, CzcD de C. metallidurans CH34 permet de résister au zinc, cobalt et nickel en absence du système d'efflux, CzcCBA. La structure du transporteur de zinc Yiip d'E. coli (Lu et al., 2009) a permis de mieux comprendre le mécanisme de fonctionnement des protéines de cette famille (Figure 16). YiiP est un dimère en forme de Y. Chaque monomère se compose de 6 segments TM, d'un domaine N-terminal et d'une longue partie C-terminale cytoplasmique riche en résidus histidines impliqués dans la reconnaissance de l'ion métallique. Chaque monomère possède 3 sites métalliques, deux mononucléaires (A et B) et un binucléaire (C). Le site C au niveau du domaine cytoplasmique détecte les ions Zn2+

, ce qui va entrainer un changement de conformation localisé. Celui-ci va être transmis aux hélices TM induisant une augmentation de l'affinité du site A pour le zinc. Ce site deviendra ainsi actif et permettra l'efflux du zinc dans le périplasme (Coudray et al., 2013; Gupta et al., 2014). Cette régulation allostérique de la protéine effectrice permet de répondre à un stress très rapidement car elle ne nécessite pas la transcription de gènes codant de nouvelles pompes d'efflux.

Figure 16 : Structure cristallographique du dimère de YiiP d'E. coli (code PDB : 2QFI) (Lu et al., 2009). (a) Chaque monomère de YiiP est représenté en jaune et en cyan. Les ions zinc liés

sont représentés par des sphères magenta entourées par des cercles en pointillés, rouge. Les sites métalliques A, B et C sont indiqués ainsi que les hélices 3 et 6. Les flèches indiquent la sortie des ions Zn2+

des sites actifs. (b) Vue de l'homodimère de YiiP depuis le périplasme. Le code couleur est identique à celui en (a). Par souci de clarté, les boucles ont été supprimées. L'ellipse rouge marque les interactions hydrophobes à l'interface des hélices TM et les losanges rouges indiquent le faisceau des 4 hélices de chaque protomère. Les hélices sont numérotées.

- D'autres systèmes tels que les protéines de type CHR, NreB et CnrT permettent le transport des métaux depuis le cytoplasme (Nies, 2003).

Les membres de la famille des protéines CHR (CHromate Resistance) sont constitués de 10 domaines TM et sont probablement des pompes d'efflux du chromate qui utiliseraient le gradient chimiosmotique comme source d'énergie. Quatre protéines de ce type seraient présentes chez C. metallidurans CH34.

NreB, caractérisée chez C. metallidurans 31A et E. coli, confère une résistance au nickel. Le gène cnrT est situé directement en aval des gènes cnrCBA codant pour la résistance au cobalt et au nickel chez C. metallidurans CH34. Le rôle de cnrT n'est pas très clair. Dans sa revue, Nies affirme que seul, le gène cnrT n'induit qu'une faible résistance au nickel sans avoir publié les données le prouvant (Nies, 2003).

NreB comme CnrT possèderaient 12 à 14 hélices TM et un domaine carboxyterminal riche en résidus histidines. Ces protéines ne possèdent pas de site de liaison à l'ATP potentiels et fonctionneraient grâce à la force protomotrice comme les protéines CDF.

b. Systèmes d'efflux de la membrane externe

La famille des protéines RND pour "Resistance Nodulation et cell Division" permet

d'ajuster la concentration en cations métalliques dans le périplasme. Le système RND est de type antiport cation-proton. Ce système est composé d'une pompe localisée dans la membrane interne (de la famille RND), d'une porine insérée dans la membrane externe (de la famille OMF pour "Outer Membrane Factor") et d'une protéine transpériplasmique (de la famille MFP pour "Membrane Fusion Protein") qui couple les deux protéines membranaires. La porine OMP et le transporteur sont des homotrimères d'environ 150 et 330 kDa respectivement alors que la protéine MFP est un héxamère d'environ 250 kDa. Le complexe de ces trois protéines forme un canal par lequel les cations métalliques en excès sont extrudés à l'extérieur de la cellule. Ce transport nécessite de l'énergie provenant du gradient de proton de la membrane interne (Nies, 2007).

Un des systèmes bien caractérisé est le transporteur CusCBA d'E. coli responsable de l'export des ions cuivreux (Cu+

) et argent (Ag+

CusA (1047 résidus) est une protéine composée de 12 hélices TM et deux grandes boucles périplasmiques (Saier et al., 1994).

C'est un homotrimère qui capte les métaux du cytoplasme et du périplasme. L'héxamère de CusB fixe les métaux du périplasme par son interaction avec la forme métallée de la protéine chaperon CusF et servirait d'intermédiaire entre CusA et CusC. CusC forme un canal en hélices α dans le périplasme qui se prolonge dans la membrane externe par un tonneau β et permet l'export des ions métalliques dans le milieu extérieur (Figure 18).

Le mécanisme proposé pour l'export des ions métalliques est le suivant : CusA possède des paires de méthionines dans son domaine périplasmique et membranaire qui forment un chemin que peuvent emprunter les ions Cu+

et Ag+

(Figure 17). En l'absence de métal, le domaine périplasmique de CusA serait dans une conformation fermée. En présence de cuivre ou d'argent, ce domaine s'ouvrirait. Ces métaux se fixeraient au niveau d'un des trois sites métalliques formés par les méthionines au niveau périplasmique ou via la paire de méthionines dans le domaine TM. CusF transfert directement les ions métalliques aux sites métalliques périplasmiques de CusB qui les délivre aux paires de méthionines de CusA. Les métaux seraient acheminés jusqu'à la paire de méthionine M755/M271 puis seraient transmis à CusC qui les exportent jusqu'au milieu extracellulaire (Long et al., 2012). Les structures cristallographiques de CusBA et CusC ont été déterminées séparément (Kulathila et al., 2011; Su et al., 2011) (Figure 18).

Figure 17 : La voie de transport du cuivre et de l'argent proposée pour la pompe CusA et la

structure cristallographique du complexe CusBA. (a) Les cinq paires de méthionines de la forme apo de CusA forment un chemin pour l'export des ions Cu+

et Ag+

. Ces méthionines sont représentées sous forme de sphères (les carbones en magenta, les oxygènes en rouge, les azotes en bleu et les souffres en orange). La paire M271-M755 est située au bout du canal périplasmique où les métaux pourraient être relargués pour l'extrusion finale. Le chemin emprunté par les métaux est représenté par une flèche noire. (b) Structure d'un protomère de CusA en vert et de deux protomères de CusB en rouge et bleu. DC, DN, PC1, PC2 et PN2 sont des sous domaines de CusA. (c) Structure du complexe CusBA. Le code couleur est similaire à celui de (b) (Long et al., 2012).

Figure 18 : Structure cristallographique de la pompe d'efflux CusCBA d'E. coli. (A) Structure

de CusBA (code PDB : 3NE5) (Su et al., 2011). (B) Structure de CusC (code PDB : 3PIK) (Kulathila et al., 2011).

C. metallidurans CH34 possède au moins 12 opérons codant des systèmes d'efflux de

métaux de type RND. Les systèmes les plus connus à l'heure actuelle sont CzcCBA pour l'efflux des cations cobalt, zinc et cadmium, CnrCBA pour le cobalt et le nickel et SilCBA pour l'argent (Nies, 2003). Comme décrit dans la section I.C., les concentrations périplasmiques en cations métalliques peuvent aussi jouer le rôle de molécules signal dans les systèmes à deux composants ou dépendants des facteurs sigma de type ECF, induisant la régulation de l'expression des opérons codant les pompes d'efflux RND (van der Lelie et al., 1997; Nies, 2004).