Résultats complémentaires et discussion :

1. Expression d’autres gènes induits par l’IFN après activation du TLR7

En plus de MxA, CXCL10 et TRAIL, nous avons analysé la transcription d’autres gènes connus pour être induits par l’IFN comme IRF7 et G1P3. Ainsi nous avons pu observer que ces deux gènes sont transcrits dès 4 h après activation des cellules GEN2.2 par les deux types de ligands de TLR7 (Figure R1.A et B). Le taux d’expression de ces gènes est cependant plus élevé dans les cellules stimulées par Flu qu’après activation par le CL097.

A

B

Figure R1. Les gènes induits par l’IFN sont exprimés par les cellules GEN2.2 activées par

les deux types de ligands de TLR7. Les cellules GEN2.2 ont été activées ou non par Flu et

le CL097 à différents temps. Les ARN ont été extraits pour la mesure de la transcription de (A) IRF7 et de (B) G1P3 par PCR quantitative.

2. Hypothèse d’une boucle autocrine intracellulaire

Il a été émis l’hypothèse que les IFN de type I produits pourraient se fixer à leur récepteur via une voie vésiculaire intracellulaire conduisant à l’expression des gènes induits par l’IFN. Cependant, ce mécanisme possible ne semble pas avoir lieu dans nos cellules et il ne pourrait pas expliquer l’expression des gènes induits par l’IFN dans le cas de la stimulation des cellules par le CL097. En effet, aucune production d’IFN de type I (Figure 2.A) ni transcription des ARNm des IFN de type I (Figure 2.B) ne sont détectées dans les cellules GEN2.2 activées par le CL097. De plus, les analyses de cytométrie en flux de

l’immunomarquage intracellulaire de l’IFN-α montrent très peu de pDC IFN-α+

après stimulation du TLR7 par le CL097 (Figure 2.C) alors que la majorité des

0 0.5h 2h 4h 24h 0.0 0.5 1.0 1.5 medium Flu CL097 IR F 7 ( re la ti c e C t) 0 0.5h 2h 4h 24h 0.0 0.5 1.0 1.5 medium Flu CL097 G 1 P 3 ( re la ti c e C t)

cellules expriment TRAIL. Par ailleurs, le taux de production de CXCL10 dans les surnageants est similaire à celui atteint après stimulation par Flu (Figure 3.B-D). Ces données concordent avec l’absence de production d’IFN de type I, intracellulaire ou extracellulaire, quand le CL097 est utilisé pour l’activation du TLR7. Néanmoins, un doute persiste dans le cas de la stimulation par Flu dans

lequel un grand nombre de pDC sont positives pour l’IFN-α intracellulaire.

Parce que la transfection des cellules GEN2.2 avec un shRNA ciblant l’ARNm de l’IFNAR2 aurait été trop longue à établir (production des particules lentivirales + définition des séquences shRNA efficaces + culture des cellules transfectées par sélection antibiotique + obtention d’un clone positif par culture en dilution limite), nous avons testé, sous demande d’un reviewer, la pré-incubation des cellules avec les anticorps neutralisants anti-IFNAR afin d’interférer avec la voie de signalisation intracellulaire possible.

Figure R2. L’expression des gènes induits par l’IFN après stimulation du TLR7 est

indépendante d’une boucle autocrine de l’IFN de type I intracellulaire. Des PBMC

sont incubées en présence ou non d’anticorps neutralisants anti-IFNAR

(anti-IFNα/βR) pendant 30 ou 60 min ; les cellules sont ensuite stimulées ou non par Flu et

CL097 pendant 4 h. (A) l’expression de TRAIL a été évaluée par cytométrie en flux sur les pDC BDCA4+ HLA-DR+ et (B) la production de CXCL10 a été mesurée dans les surnageants de culture par CBA.

Les résultats de cette expérience démontrent clairement que la pré-incubation des cellules pendant 30 ou 60 min avec les anticorps neutralisants n’altère pas l’expression de TRAIL (Figure R2.A) des pDC issues du sang

activées par Flu ou le CL097. Des résultats similaires ont été obtenus pour la production de CXCL10 dans les surnageants (Figure R2.B). Ces anticorps sont cependant efficaces pour le blocage de l’expression des gènes induits par

l’IFN après stimulation des cellules par de l’IFN-α exogène. Nous pouvons alors

conclure que l’activation des pDC décrite dans ce papier n’implique pas une voie de signalisation par boucle autocrine de l’IFN de type I intracellulaire.

3. Hypothèse de l’implication des IFN de type III

Il a été supposé que les IFN de type III (IFN-λ, IL-28 et IL-29) pouvaient être à l’origine de l’expression observée des gènes induits par l’IFN. En effet, même s’ils se fixent sur des récepteurs différents (IL-28R/IL-10R), les IFN de type III entraînent l’activation de voies de signalisation similaires à celles induites par l’engagement des IFN de type I sur leur récepteur(Zhou et al. 2007). Cependant même si la stimulation Flu permet d’activer la transcription du gène codant pour l’IL-28, aucune expression de ce gène n’a pu être détectée dans les cellules activées par le CL097 (Figure R3). Par ailleurs, nous avons montré qu’aucun facteur extracellulaire n’était impliqué dans l’expression des gènes induits par l’IFN (Figure 4C). De plus, l’expression de TRAIL des cellules GEN2.2 exposées aux surnageants de cellules activées par Flu est inhibée par des anticorps neutralisants la voie de signalisation des IFN de type I, suggérant que seuls les IFN de type I sont capables d’induire une telle expression dans notre modèle (Figure 4B).

Figure R3. Transcription de l’IL-28A par les

cellules GEN2.2 activées. Les cellules

GEN2.2 ont été activées ou non pendant

24 h par Flu, CL097 et de l’IFN-α

exogène. Les ARN ont été extraits pour

une analyse par RT-PCR de la

transcription des gènes ISG TRAIL et CXCL10 et des cytokines IL-6 et IL-28A.

Article 2. A novel signalling pathway leading to