Réponse cellulaire des archéobactéries halophiles après inhibition du protéasome par la drogue NLVS

Nous n’avons pas pu réaliser des mutants (KO) de protéasome ou des protéines PANs, nous avons donc décidé d’étudier la réponse cellulaire d’Halobacterium à une inactivation chimique du protéasome par l’utilisation de drogue inhibant son activité. Chez les archéobactéries, l’inhibition de l’activité du protéasome a été effectuée sur l’archéobactérie

Thermoplasma acidophilum en utilisant le NLVS comme inhibiteur (Ruepp et al.,1998). Le

NLVS ou tripeptidyl vinyl sulfone inhibe l’activité trypsine-like, chymotrypsine-like et l’activité peptidyl gultamyl du protéasome via la modification irréversible des sites actifs thréonine des extrémités N-terminales des sous-unités bêta du protéasome (Bogyo et

al.,1997). L’inhibition de l’activité du protéasome archéobactérien par le NLVS n’avait

apparemnt aucun effet sur la croissance de Thermoplasma acidophilum, indiquant que le protéasome n’est pas essentiel dans les conditions normales de croissance. Cependant l’inhibition du protéasome au cours d’un stress thermique résulte en une incapacité des cellules à surmonter le stress. Il était donc intéressant de tester la réponse cellulaire des archéobactéries halophiles aux stress salin lorsque celles-ci sont incubées en présence d’une drogue inhibitrice du protéasome. L’objectif était également d’observer le comportement des protéines PANs et du thermosome en situation de détresse protéolytique.

. Nous avons testé plusieurs concentrations de drogue (15 µM et 30 µM) sur les deux souches dont on dispose au laboratoire : Halobacterium salinarium et Haloarcula

marismortui. Nous avons donc ajouté la drogue à des cellules en début de phase de croissance

et nous avons suivi la croissance de ces cellules par mesure de la densité optique. Les résultats de la figure 32 ont montré qu’en conditions de cultures normales, les cellules étaient

Figure 32 : Réponse des archéobactéries halophiles après l’addition de la drogue inhibitrice du protéasome NLVS.

A gauche : Réponse cellulaire d’Halobacterium salinarium au cours de la croissance après l’addition de la drogue inhibitrice du protéasome NLVS. Les cellules issues d’une phase stationnaire ont été reprises dans des milieux contenant 4,2M NaCl (C = contrôle sur la figure) ou en présence de 3 M NaCl (S sur la figure) en absence et en présence de 30 µM de NLVS.

A droite : Réponse cellulaire d’Haloarcula marismortui au cours de la croissance après l’addition de la drogue inhibitrice du protéasome NLVS. Les cellules issues d’une phase stationnaire ont été reprises dans de milieux contenant 3,5 M NaCl (C= contrôle sur la figure) en en présence de 2,5 M NaCl (S= stress sur la figure) en absence et en présence de 30 µM de NLVS.

Nous avons testé si les cellules pouvaient surmonter le stress en présence de la drogue inhibitrice. Les cellules ont été donc incubées dans des milieux de culture contenant des concentrations de sel différentes (nous avons choisi 3 M pour Halobacterium et 2,5 M pour

Haloarcula marismortui qui correspondent à une situation de stress non létale pour les

cellules), et la drogue a été ensuite ajoutée au début de la phase de croissance. Nous avons ensuite suivi la croissance par un suivi de la densité optique.

Aucune différence sur la croissance entre les cellules stressées ou non stressées n’a été observée pour Halobacterium salinarium. Par contre, pour Haloarcula marismortui, les cellules stressées à 2,5 M en sel en présence de la drogue ont poussé normalement jusqu’à en milieu de la phase exponentielle et meurent.

À ce stade du travail, il est nécessaire de faire un contrôle pour tester l’efficacité de la drogue sur le protéasome à la fois in vivo et in vitro, nous ne savons pas si la différence observée pour la réponse de la drogue entre Halobacterium salinarium et Haloarcula marismortui est due à

une inefficacité de la drogue à pénétrer dans le cytoplasme d’Halobacterium salinarium. Il est aussi possible qu’à de concentrations en sel très hautes (4,2 M, ou 3 M), la drogue est moins soluble ce qui la rend inefficace.

Nous avons aussi testé la réponse à la drogue en présence d’un stress thermique (Résultats non montrés). L’expérience consistait à faire un choc thermique de 15 min à 60°C et remettre les cellules à pousser normalement. Nous n’avons pas vu de différence entre la croissance des cellules en présence ou en absence de drogue.

En parallèle à notre étude sur la réponse cellulaire à la drogue après un stress ou une adaptation, nous avons étudié la réponse cellulaire au bout de trois heures de l’ajout de la drogue chez Haloarcula marismortui en l’absence d’un stress (nous doutions de l’efficacité de la drogue sur Halobacterium salinarium).

Nous avons étudié l’accumulation de la protéine PAN B et de TF55 dans les cellules traitées par la drogue à une concentration de 30 µM et nous avons suivi les variations de PAN B et TF55 au cours des trois heures qui suivent l’addition de la drogue (Figure 33). TET est un complexe peptidase qui a été proposé être responsable de l’élimination des peptides issus de l’activité du protéasome 20 S (Franzetti et al., 2002). Nos résultats préliminaires ont montré l’induction de TF55 et de PAN B une heure après l’ajout de la drogue d’une façon assez similaire pour les deux protéines.

Ces résultats sont intéressants car ils suggèrent une connexion entre le système chaperonne et la fonction de la protéolyse cytosolique : notez que cette connexion a été déjà proposée pour les cellules eucaryotes dans lesquelles une altération de l’activité du protéasome provoque une stimulation d’un système heat shock (Bush et al., 1997). Dans le cas de PANB, l’induction de la protéine indique que la régulation des protéines PANs est contrôlée par l’activité de la protéolyse cytoplasmique. Dans le cas de TET, nous n’observons pas d’altération supposée du niveau des protéines en réponse à une inhibition de l’activité du protéasome.

Ces résultats sont néanmoins préliminaires et nous ne pouvons pas nous prononcer de façon définitive sur l’effet de la drogue sur Haloarcula marismortui.

Figure 33 : Variation des protéines TET, TF55 et PAN B après l’addition de la drogue NLVS inhibitrice du protéasome.

Les cellules d’Haloarcula marismortui (phase exponentielle) ont été incubées en présence de 30 µM de la drogue NLVS pendant 3 heures. Aux temps indiqués, les cellules ont été récupérées par centrifugation et analysées par immunodétection.

C 1h 2h 3h

Anti-TET

Anti-TF55

Anti-PANB

+ 30 µµµµM NLVS