Discussion sur l’hétérogénéité N-terminale des protéines PANs

Nos résultats par immunodétection, et les expériences consécutives

d’immunoprécipitation, et des gels bidimensionnels ont montré que les protéines PANs s’accumulent dans la cellule sous deux formes dont l’une est tronquée en N-terminale. Cette accumulation d’une forme tronquée peut avoir diverses origines : elle peut provenir de l’utilisation d’un deuxième site de transcription, d’un deuxième site de traduction ou d’une maturation post-traductionnelle. En absence des séquences N-terminales des protéines tronquées, nous ne pouvons pas nous prononcer d’une façon définitive pour l’un de ces mécanismes, quoique nos résultats par extension d’amorce pointent sur une utilisation de deux sites de transcription. Ceci n’exclut pas cependant les autres hypothèses comme l’utilisation alternée d’un deuxième site d’initiation de la traduction ou la maturation post-traductionnelle. L’utilisation alternée d’un deuxième site de traduction est une hypothèse confortée chez PAN A par le fait qu’on observe la même forme tronquée lorsqu’on exprime la protéine PAN A dans E. coli. (Ce qui n’est pas le cas de la protéine PAN B). Cette idée est renforcée par une autre étude faite sur PAN de Méthanocaldococcus janaschii ; lorsque la protéine PAN de M.

janaschii est surexprimée dans E. coli, une deuxième forme tronquée apparaît qui résulte

d’une utilisation alternée d’un deuxième site de Shine-Dalgarno (Wilson et al., 2000). À cette indication s’ajoute aussi le fait que les protéines ClpB et de ClpA membres de la famille des AAA+ sont exprimées sous deux formes in vivo résultant d’une utilisation alternée de deux sites de traduction (Maurizi et al., 2004).

Afin de pouvoir conclure sur les mécanismes responsables de la génération de cette deuxième forme tronquée, plusieurs expériences supplémentaires doivent être réalisées :

- Obtenir les séquences N-terminales des protéines tronquées. Nos expériences précédentes par immunoprécipitation et par le gel bidimensionnel se sont confrontées à la faible quantité des protéines. L’augmentation des quantités de protéines dans ces expériences permettrait le séquençage N-terminal.

- Il serait intéressant de faire des expériences de « pulse-chase » sur les protéines PANs afin de suivre la synthèse des deux isoformes des PANs. Ces expériences permettront de voir si la forme tronquée est générée avec un certain retard par rapport à la forme complète ou pas ce qui indiquerait un mécanisme de maturation post-traductionnelle.

- exprimer hétérologuement les protéines PANs d’Halobacterium dans Haloferax volcanii. La génétique d’Haloferax est bien développée et il est facile de surexprimer les protéines contrairement à Halobacterium. L’expression hétérologue des PANs dans Haloferax volcanii permettra de vérifier si Haloferax est capable de synthétiser les deux formes de chaque PAN, et si c’est le cas d’introduire des mutations au niveau de la séquence Shine-Dalgarno et du deuxième codon initiateur et regarder si ces mutations affecteraient la synthèse de la forme tronquée des PANs.

Quelle est l’importance pour la cellule d’avoir deux versions de chaque PAN ? et en quoi consiste l’importance de cette régulation au niveau de la région N-terminale ?

Le rôle exact de la région N-terminale est encore très mal défini chez les AAA- ATPases en général. Les études structurales et biochimiques sur différents membres de la famille ont suggéré que les domaines N-terminaux constituent des domaines flexibles, distaux par rapport à l’axe de l’hexamère et localisés à l’extérieur de la surface de l’hexamère et qui joue un rôle important dans la liaison aux substrats. La région N-terminale porte aussi les sites de liaison des AAA+ à leurs adaptateurs (Dougan, 2002 ; Meyer, HH 2000). Comme les sous- unités régulatrices du protéasome, les PANs possèdent dans leur région N-terminale des motifs coiled-coil. Les coiled-coil représentent des motifs structuraux importants dans la fonction des chaperonnes, mais aussi dans toutes les liaisons protéine-protéine. Chez les rpt eucaryotes, les motifs coiled-coil sont supposés médier les interactions entre les différentes rpt (Richmond et al., 1997 ; Wollenberg et al., 2001). La région N-terminale de PAN pourrait donc influencer l’interaction des PANs avec les protéines substrats, la présence d’une forme tronquée de PAN influencerait l’interaction des PANs et la spécificité des substrats. La délétion de la région N-terminale en cas où il s’agirait d’un deuxième départ de traduction des PANs éliminerait une partie du motif coiled-coil pour PAN A (coiled-coil à 17-79 et en considérant le deuxième départ situé à + 36) et exposerait le motif coiled-coil pour PAN B. (coiled-coil 39-68 et en considérant le deuxième départ de traduction situé à + 38).

Dans le futur, il sera intéressant d’étudier l’effet de l’élimination du peptide N- terminal sur l’activité des protéines PANs in vitro et in vivo. Le comportement in vivo des différentes formes de PANs font l’objet du chapitre suivant. En ce qui concerne les propriétés

in vitro, il serait intéressant de produire des protéines recombinantes qui sont tronquées dans

leur région N-terminale et de regarder l’effet de la délétion N-terminale sur les différentes

propriétés du complexe telles : l’association, l’oligomérisation, l’activité chaperonne et l’activation de la protéolyse par le protéasome. Ces expériences devraient permettre de dire si la délétion en N-terminalcorrespond à une activation du système PAN ou à une modification des propriétés fonctionnelles du complexe. En ce qui concerne la signification physiologique du rôle du peptide N-terminal par rapport à la spécificité des complexes, seules les expériences in vivo pourraient apporter des réponses et en même temps permettre la détermination des substrats naturels spécifiques à PAN A et/ou PAN B.