I Co Régulation des PANs au cours de la croissance
I.2 Etude d’expression des PANs au cours de la croissance
Afin d’étudier le rôle des PANs au cours de la croissance chez Halobacterium
salinarium, les cellules ont été transférées dans un nouveau milieu et différents points de la
croissance correspondant à divers stades de la croissance ont été aliquotés afin de les analyser au niveau transcriptionnel et post-transcriptionnel.
Halobacterium salinarium montre une courbe de croissance typique des bactéries avec une
phase de latence rapide, une phase exponentielle dans laquelle le nombre de cellules augmente d’une façon exponentielle et une phase stationnaire où les cellules arrêtent de se diviser. Le temps de génération d’Halobacterium salinarium est de 10 heures comme le montre la figure 25.
Figure 25 : Courbe de croissance typique d’Halobacterium salinarium.
Halobacterium salinarium présente une courbe de croissance typique avec un temps de
génération relativement long de l’ordre de 10 heures. La phase de latence est très courte, la phase exponentielle dure environ 40 heures, et une phase stationnaire avant que les cellules ne commencent à mourir.
I.2.1
Régulation au niveau transcriptionnel
Les ARNm accumulés dans les cellules des différentes phases de la croissance ont été extraits, et les variations des transcrits PANA, PANB et celui de la sous-unité alpha du protéasome (psmA) ont été détectés par autoradiographie par des sondes ARN « anti-sens » dirigés contre les ARNm de PAN A et PANB et la sous-unité alpha du protéasome. Au cours de la croissance, les ARNm de PAN A, PAN B et la sous-unité alpha (psmA) sont détectés sous forme d’ARNm monocistroniques dont la taille correspond à celle prédite pour les gènes
PAN A (1218 p.b), PAN B (1236 p.b) et le gène psmA (732 p.b).
Les résultats par Northern Blot (Figure 26) ont montré une accumulation des ARNm très similaire pour les deux PANs. En effet, le niveau des transcrits augmente d’une façon significative dès l’entrée des cellules en phase exponentielle, atteint son maximum au milieu de la phase exponentielle, puis décroît remarquablement à la phase de transition entre la phase
exponentielle et la phase stationnaire. Quand les cellules rentrent en phase stationnaire, une nouvelle augmentation des niveaux des transcrits PAN A et PAN B est observée.
Quant à la sous-unité alpha du protéasome, les résultats du « Northern blot » ont montré que les niveaux étaient plus ou moins constants tout au long de la croissance avec une légère diminution au milieu de la phase exponentielle, et une diminution de ces niveaux quand les cellules sont en fin de phase stationnaire. Les variations de la sous-unité alpha du protéasome ne corrélaient pas avec les mêmes variations observées dans le cas des PANs. Nos résultats montrent que le niveau des transcrits des PANs est régulé. Deux niveaux de régulation ont été observés : une première régulation dès l’entrée des cellules en phase exponentielle, une deuxième régulation dès l’entrée des cellules en phase stationnaire. Quant à la sous-unité alpha du protéasome ; les variations du niveau des transcrits sont observées uniquement en fin de phase stationnaire.
Figure 26: Variation des transcrits PAN A et PAN B et celle de la sous-unité alpha du protéasome au cours de la croissance.
Des cellules ont été prélevées à différents temps de croissance qui sont indiqués par une flèche sur la courbe, et les ARNm de ces points sont extraits et sont séparés sur un gel d’agarose – formaldéhyde et transférés sur membrane de nitrocellulose. Le dépôt des échantillons est vérifié par les ARN ribosomiques 23S et 16S suite à une coloration du gel au bromure d’éthidium (panneau du bas). Les différents transcrits sont ensuite détectés par les sondes ARN anti-sens synthétisées in vitro et marqués radioactivement au 32 P. Les transcrits sont ensuite détectés par autoradiographie. Sonde panA Sonde panB 23S 16S Sonde psma
I.2.2
Régulation au niveau protéique
Dans un deuxième temps, nous avons voulu vérifier si la régulation au niveau transcriptionnelle se reflète au niveau protéique. Nous étions aussi intéressés à suivre les variations des isoformes des PANs au cours de la croissance. Les échantillons de cellules utilisées pour les analyses en Northern Blot ont été analysés par immunodétection. Nous avons uniquement pu suivre le changement des niveaux des protéines PAN A et PAN B car nous n’avons pas pu obtenir un anti-protéasome de qualité. Les anticorps dirigés contre les sous-unités du protéasome donnaient un signal très faible et non exploitable même après des essais de purification de l’anticorps.
Les résultats de l’immunodétection des PANs A et des PANs B (Figure 27) montrent que le niveau des protéines des PANs variait au cours de la croissance. En effet, une variation est observée lorsque les cellules entrent au début de la phase exponentielle, les niveaux protéiques diminuent légèrement à la transition entre la phase exponentielle et la phase stationnaire, une autre petite augmentation est ensuite observée lorsque les cellules entrent en phase stationnaire. Les deux isoformes de chaque protéine variaient d’une façon très similaire au cours de la croissance. La régulation des niveaux de protéines PANs corrèle avec les variations observées au niveau des ARN messagers, Cependant la variation des protéines n’est pas aussi marquante que celles observées au niveau de l’ARNm. Ce qui suggère que la régulation des gènes PANs se fait essentiellement au niveau de la transcription, et que la demie-vie des protéines PANs in cellulo est relativement longue ce qui explique que les variations constatées au niveau des ARNm se réflètent avec une moindre ampleur au niveau protéique.
Figure 27 : Variation des niveaux protéiques de PAN A et de PAN B au cours de la croissance.
Les extraits protéiques totaux de différentes phases de la croissance ont été séparés sur un gel de polyacrylamide 12%. La présence des protéines PANs ainsi que leurs isoformes est ensuite détectée par des anticorps spécifiques dirigés contre PANA et PAN B. Les échantillons prélevés sont indiqués par une flèche sur la courbe.
Anti-PAN A Anti-PANB Isoforme longue Isoforme courte Isoforme longue Isoforme courte