Régulation par ubiquitination

La modification post-traductionnelle des ligands DSL par ubiquitination contribue à la régulation des niveaux de surface des ligands en régulant leur endocytose, et elle est absolument requise pour leur activité de signalisation (Le Borgne and Schweisguth 2003, Nichols, Miyamoto et al. 2007, Weinmaster and Fischer 2011). Tel que mentionné plus haut, les domaines intracellulaires des ligands Delta et Serrate de la Drosophile, et des ligands Dll1, Dll4, Jag1, et Jag2 des mammifères, contiennent plusieurs résidus lysines qui constituent des sites potentiels d'ubiquitination par deux enzymes E3 ubiquitine ligase à domaines RING « Really Interesting New Gene », et à structures distinctes; Neur et Mib. L'enzyme Neur a été initialement identifiée par criblage chez la Drosophile, et sa fonction a été par la suite amplement caractérisée par des études chez la Drosophile et le Xénope (Deblandre, Lai et al. 2001, Lai, Deblandre et al. 2001, Pavlopoulos, Pitsouli et al. 2001, Yeh, Dermer et al. 2001, Le Borgne and Schweisguth 2003, Bardin and Schweisguth 2006). De son côté, l'enzyme Mib fut identifiée par des études de criblage chez le poisson zébré (Itoh, Kim et al. 2003, Chen and Casey Corliss 2004); et tout comme pour Neur, il a été démontré que Mib est capable de se lier à Delta et de l'ubiquitiner pour réguler son endocytose et son activité (Koo, Lim et al. 2005).

Le génome de la Drosophile code pour un seul gène Neur (dNeur), et deux gènes Mib (dMib1 et dMib2) qui régulent des événements Notch-dépendants distincts, possiblement à travers des profils d'expression distincts de ces E3 ligases in vivo (Lai, Roegiers et al. 2005, Le Borgne, Remaud et al. 2005, Pitsouli and Delidakis 2005, Wang and Struhl 2005). De plus, des domaines intracellulaires distincts des ligands régulent leur liaison et leur ubiquitination par Neur et par Mib respectivement, tel que démontré pour Delta (Daskalaki, Shalaby et al. 2011). Donc en gros, les enzymes Neur et Mib sont toutes les deux capables d'ubiquitiner les ligands Delta et Serrate de la Drosophile pour stimuler leur endocytose et leur activité de signalisation, et des études génétiques de compensation ont montré que les membres de ces

deux classes distinctes d'E3 ubiquitine ligases sont principalement redondants du point de vue fonctionnel chez la mouche.

Contrairement à leurs fonctions équivalentes chez la Drosophile, les gènes Neur et Mib auraient évolué pour effectuer des rôles distincts dans la signalisation Notch chez les vertébrés. En effet, il a été démontré que Neur1 et 2 sont dispensables pour le développement normal chez la souris, et que la déficience en Neur1, Neur2, et Mib2 ne conduit pas à des phénotypes développementaux reliés à la signalisation Notch, alors que la déficience additionnelle en Mib1 entraîne des phénotypes de létalité embryonnaire associés à Notch (Koo, Yoon et al. 2007). De même, la perturbation uniquement du gène Mib1 produit à elle seule des phénotypes de perte de fonction de Notch dans les embryons de souris en développement (Barsi, Rajendra et al. 2005, Koo, Lim et al. 2005). Mib1, et non Mib2, est fortement exprimé durant le développement embryonnaire (Koo, Yoon et al. 2007), ce qui justifie la nécessité absolue de Mib1 pour les événements développementaux Notch- dépendants. Alors que les gènes Mib1 et Mib2 semblent redondants du point de vue fonctionnel (Zhang, Li et al. 2007), les gènes Neur1 et Neur2 ne sont pas capables de sauver le phénotype neurogénique résultant de la perte de fonction de Mib1 chez le poisson zébré par exemple (Koo, Yoon et al. 2005). De plus, des études cellulaires ont montré que chez les mammifères, Mib serait l'enzyme E3 ubiquitine ligase responsable de l'endocytose des ligands DSL et activant la signalisation Notch, alors que Neur agirait en aval de Mib afin d'orienter la dégradation lysosomale des ligands internalisés, régulant ainsi les niveaux de ligands disponibles pour l'activation de Notch (Song, Koo et al. 2006).

Les fonctionnalités différentes de Neur et Mib chez les vertébrés pourraient refléter des états d'ubiquitination différents des ligands induits par ces deux classes structurellement distinctes d'enzymes E3 ubiquitine ligases. En effet, les ligands DSL peuvent être mono- et/ou poly-ubiquitinés, et les conséquences fonctionnelles de ces différents types d'ubiquitination sur la signalisation Notch ne sont pas bien caractérisées (Staub and Rotin 2006). De plus, Neur et Mib pourraient réguler différentiellement l'activité des ligands en modifiant des résidus lysines distincts dans le domaine intracellulaire des ligands, comme illustré pour le ligand Delta chez la Drosophile (Daskalaki, Shalaby et al. 2011). Ainsi, il a été démontré que la mutation de deux lysines intracellulaires de Serrate produit des défauts de signalisation Notch associés à un

défaut d'endocytose des ligands et à leur accumulation à la surface cellulaire (Glittenberg, Pitsouli et al. 2006). Par contre, la mutation de la totalité des 17 résidus lysines intracellulaires de Dll1 murin n'entraîne pas de défaut d'internalisation de Dll1, mais conduit plutôt à un défaut de recyclage des ligands associé à un défaut de leur localisation aux « radeaux lipidiques » de la membrane plasmique, et à une réduction de leur efficacité de liaison aux récepteurs Notch, se reflétant par une absence d'activation de la signalisation. D'autre part, un ligand chimérique Dll1-Dll3 qui contient le domaine extracellulaire de Dll1 fusionné aux domaines transmembranaire et intracellulaire de Dll3 est internalisé, et recyclé normalement malgré l'absence des lysines intracellulaires requises pour l'ubiquitination. Cependant, cette chimère présente un défaut de localisation aux « radeaux lipidiques », et est incapable d'activer la signalisation Notch malgré une grande affinité de liaison au récepteur (Heuss, Ndiaye- Lobry et al. 2008). Ceci souligne l'importance de l'ubiquitination des ligands DSL pour leur activité de signalisation, et suggère que l'ubiquitination ne serait pas requise principalement pour l'endocytose constitutive des ligands, mais plutôt pour les événements d'internalisation spécifiques à l'activation de la signalisation. Plus récemment, une analyse mutationnelle fonctionnelle de chacune des lysines intracellulaires de Dll1 a démontré que la lysine 613 constitue le résidu clé pour la trans-activation de Notch. Étonnamment, les ligands mutants pour ce résidu possèdent une capacité normale de trafic et de recyclage, mais présentent un défaut de multi-ubiquitination et d'interaction avec Notch1, et une rétention excessive au niveau des « radeaux lipidiques » (Zhang, Widau et al. 2011). Finalement, des analyses structurales et fonctionnelles ont porté sur les enzymes E3 ubiquitine ligases en soi afin de comprendre leurs mécanismes de régulation des ligands DSL dans la signalisation Notch. Celles-ci comprennent des études de Neur chez la Drosophile (He, Saito et al. 2009, Liu, Bonner et al. 2012), et une étude très récente portant sur des analyses cristallographiques, biochimiques, et cellulaires de deux domaines distincts de reconnaissance des ligands au niveau de Mib1 (McMillan, Schnute et al. 2015).