Effet de la déplétion de Tmem128 sur les niveaux d'expression de Dll1 par qPCR

Par la suite, nous avons évalué par qPCR l'effet de la déplétion de Tmem128 sur l'expression de l'ARNm de Dll1, en utilisant les cellules OP9-CTL et OP9-DL1 comme contrôles. Étant donné que les cellules OP9-CTL expriment la GFP seule, et que les cellules OP9-DL1 expriment à la fois Dll1 et GFP à partir du même transcrit bicistronique, nous avons aussi regardé les niveaux d'expression de la GFP pour vérifier s'ils sont affectés par la perte de fonction de Tmem128. Ceci suggérerait que Tmem128 régule la transcription des gènes dans la lignée OP9 à travers le promoteur exogène MSCV. Cependant, les expériences de qPCR ont démontré que ni Dll1 ni la GFP ne sont affectés de façon significative par la réduction de l'expression de Tmem128 dans les cellules OP9-DL1 (Figure 15).

Figure 15 : Effet de la déplétion de Tmem128 sur l'expression de Dll1.

qPCR montrant que les niveaux d'expression de Dll1 et de GFP ne sont pas affectés de façon significative suite à la déplétion stable de Tmem128 dans les cellules OP9-DL1. Les données proviennent de 3 expériences indépendantes et représentent la moyenne et la SEM. Les valeurs-p sont

4.1.4. Effet de la déplétion de Tmem128 sur les niveaux d'expression et la

protéolyse de DLL1 par immunobuvardage de type western

Étant donné que Tmem128 ne semble pas affecter la transcription de Dll1 de façon significative, nous nous sommes demandé s'il ne régulerait pas plutôt les niveaux d'expression de la protéine DLL1, ce qui expliquerait les phénotypes d'inhibition de Notch suite à la déplétion de Tmem128. Pour cela, nous avons évalué l'effet de la déplétion de Tmem128 sur l'expression de DLL1, ainsi que sur sa stabilité, en mesurant la quantité globale de DLL1, et sa protéolyse par immunobuvardage de type western. Étant donné que l'endocytose de Dll1 est Mib1-dépendante, et qu'il a été suggéré que l'endocytose des ligands les protègerait contre la protéolyse (Heuss, Tarantino et al. 2013), nous avons aussi testé l'effet de la déplétion de Mib1 sur l'expression et la stabilité de la protéine DLL1 en utilisant la lignée stable shMib1 (Figure 11A page 88). Ainsi, nous avons utilisé un anticorps monoclonal anti-T7 pour détecter le domaine intracellulaire de la protéine DLL1, parce que cette dernière est sur-exprimée de façon exogène dans la lignée OP9-DL1, et elle possède un « tag » T7 en position C-terminale. L'anticorps anti-T7 est capable de reconnaître spécifiquement le fragment entier, ainsi que le fragment transmembranaire de DLL1 issu du clivage par ADAM. Vu que DLL1 est séquentiellement clivé par ADAM et par la gamma-sécrétase, nous avons utilisé l'inhibiteur de la gamma-sécrétase (DAPT) afin de stabiliser ce fragment transmembranaire du ligand qui est à la fois le produit d'ADAM et le substrat de la gamma-sécrétase. Ceci nous a permis de bien visualiser ce fragment transitoire de clivage. Cette expérience a démontré que la réduction de l'expression de Tmem128 dans les cellules OP9-DL1 conduit à une légère réduction de l'expression globale de DLL1 de 20%, mais qu'elle n'affecte pas la protéolyse de DLL1. Au contraire, comme attendu, la déplétion de Mib1 augmente de 3 fois la proportion du fragment clivé par rapport au fragment complet de DLL1. Cependant, étonnamment, cette augmentation de la protéolyse est aussi accompagnée par une légère augmentation des niveaux du fragment entier de DLL1 (Figure 16). Ceci suggère qu'en plus de favoriser le clivage de DLL1, shMib1 stabiliserait une forme non fonctionnelle du fragment complet de DLL1 et limiterait son recyclage ou « turn-over ».

Figure 16 : Effet de la déplétion de Tmem128 sur l'expression et le clivage de DLL1.

A. Expérience d'immunobuvardage représentative montrant la détection dans les cellules OP9-DL1 du fragment complet, ainsi que du fragment transmembranaire clivé de DLL1. B. Graphique de gauche:

Quantification de l'expression relative du fragment entier de DLL1 dans chaque condition, en normalisant à l'intensité de la bande d'actine correspondante. Graphique de droite: Quantification du ratio du fragment clivé par rapport au fragment complet de DLL1 dans chaque condition. Les données

proviennent de 3 expériences indépendantes et représentent la moyenne et la SEM. Toutes les valeurs ont été calculées par rapport aux cellules OP9-DL1 non transduites.

4.1.5. Effet de la déplétion de Tmem128 sur la localisation sub-cellulaire de

DLL1 par immunofluorescence

Compte tenu de l'effet léger de Tmem128 sur les niveaux d'expression globale de DLL1, nous nous sommes demandé si Tmem128 ne jouerait pas plutôt un rôle dans la distribution sub-cellulaire du ligand afin d'affecter sa fonction de signalisation. Pour cela, nous avons effectué un marquage par immunofluorescence des cellules OP9-DL1 en utilisant l'anticorps anti-T7 qui reconnaît le domaine intracellulaire du ligand. Cette expérience a montré que la distribution globale de DLL1 dans les cellules OP9-DL1 ne semble pas affectée par la déplétion de Tmem128. Ainsi DLL1 est détectée de façon similaire dans des vésicules intracellulaires et à la membrane plasmique dans les deux conditions: shNT, et shTmem128; suggérant un cycle de trafic normal de DLL1 par endocytose dans les deux cas (Figure 17A). D'autre part, étant donné que TMEM128 a été détecté au RE dans nos cellules, suggérant ainsi une fonction de cette protéine au niveau du RE, nous avons effectué un co-marquage de DLL1 avec le marqueur KDEL afin de vérifier si le ligand ne serait pas piégé au RE au cours de ses étapes précoces de bio-synthèse suite à la déplétion de Tmem128. Cependant, encore une fois, cet essai ne nous a pas permis de distinguer une différence nette entre les deux conditions: shNT, et shTmem128; et nous avons été incapables de détecter DLL1 au RE dans les deux cas (Figure 17B). Donc en gros, nos données suggèrent que, contrairement à toute attente, Tmem128 ne semble pas contrôler le trafic et la localisation de DLL1 dans les cellules OP9- DL1.

Figure 17 : Effet de la déplétion de Tmem128 sur la localisation sub-cellulaire de DLL1.

A. Images représentatives de la distribution de DLL1 (en rouge) dans les cellules contrôles et les cellules OP9-DL1 shTmem128. B. Images de fluorescence représentatives montrant que DLL1 (en rouge) ne co-localise pas avec le marqueur KDEL du RE (en vert) dans les cellules OP9-DL1 shNT et

4.1.6. Effet de la déplétion de Tmem128 sur la distribution de DLL1 dans