De nombreux agents régulent l’expression du système VIP-récepteurs dans des lignées de neuroblastome (Tableau VIII).
L’expression du VIP, des peptides précurseurs et/ou de l’ARNm VIP est stimulée par le dibutyryl AMPc (dBcAMP) et par des agents induisant une augmentation du taux d’AMPc (Yanaihara et al., 1981 ; Hayakawa et al., 1984 ; Brick et al., 1985 ; Svoboda et al., 1986 ; Waschek et al., 1988 ; Agoston et al., 1992 ; Kimura et al., 1992 ; Adler et al., 1993). En outre, ces agents sont connus pour induire la différenciation de cellules de neuroblastome. Les esters de phorbol peuvent également augmenter l’expression du VIP (Waschek et al., 1988 ; Ohsawa et al., 1985 ; Agoston et al., 1992 ; Kimura et al., 1992 ; Hahm et Eiden, 1999), tout comme le Ca2+, qui stimule l’expression de l’ARNm VIP dans les cellules SH-SY5Y (Adler et al., 1993).
Dans la lignée IMR-32, l’expression du PACAP est augmentée par les esters de phorbol et le dBcAMP (Suzuki et al., 1994b).
L’acide rétinoïque régule différents éléments du système VIP-récepteurs. En effet, il induit non seulement l’expression de l’ARNm et/ou du peptide VIP, mais il augmente aussi le nombre de sites de liaison du VIP dans plusieurs lignées de neuroblastome (Waschek et al., 1989 ; 1997 ; Agoston et al., 1992 ; Pence et Shorter, 1992 ; Georg et al., 1994 ; Hashemi et al., 2003). Contrairement à ses effets sur l’expression du VIP, l’acide rétinoïque diminue l’expression du PACAP dans les cellules IMR-32 (Waschek et al., 1997). L’acide rétinoïque diminue l’expression des récepteurs PAC1 et VPAC2 dans la lignée SH-SY5Y (Waschek et al., 1997 ; Lutz et al., 2006). Dans la lignée LA-N-5, l’expression du VIP induite par l’acide rétinoïque est concomitante de la différenciation morphologique. De plus, des antagonistes du VIP diminuent l’effet de l’acide rétinoïque, suggérant que le VIP est impliqué dans cette
Régulateurs Effets Lignées cellulaires Références ↑ Peptide VIP ou
précurseurs NB-1, N18TG2, SH-SY5Y 1-7 ↑ ARNm VIP NB-1, SH-SY5Y 5, 8, 9 Analogues de
l’AMPc
↑ peptide PACAP IMR-32 11 ↑ peptide VIP NB-1, SH-SY5Y 5, 7 ↑ ARNm VIP NB-1, SH-SY5Y,
SK-N-SH 5, 6, 9, 10 Esters de phorbol
↑ peptide PACAP IMR-32 11
Ca2+ ↑ ARNm VIP SH-SY5Y 8
↑ peptide VIP SH-SY5Y, LA-N-5,
NB-1 6, 12, 14-16 ↑ ARNm VIP SH-SY5Y, IMR-32, LA-N-5, NB-1 6, 13, 15 ↑ sites de liaisons SH-SY5Y, IMR-32, LA-N-5 12-14 ↓ ARNm PACAP IMR-32 13 Acide rétinoïque
↓ ARNm PAC1, VPAC2 SH-SY5Y 13, 17
↑ peptide VIP NBFL 18
CNTF, TGF-ß et
facteurs apparentés ↑ ARNm VIP NBFL 18-21 ↑ peptide VIP SH-SY5Y, NB-1, BE(2)M17 6,22 Carbamylcholine
↑ ARNm VIP NB-1, BE(2)M17 22
↑ peptide VIP LA-N-5 24
↑ sites de liaison LA-N-5 24 VIP
↑ peptide PACAP IMR-32 11
↑ peptide VIP NB-1 23
↑ ARNm VIP NB-1 23
↑ peptide PACAP IMR-32 11 PACAP
↑ ARNm PACAP IMR-32 11
Tableau VIII : Régulation de l’expression du système VIP-récepteurs dans les cellules de neuroblastomes (d’après Muller et al., 2006)
↑ : augmentation, ↓ : diminution.
1 : Yanaihara et al., 1981 ; 2 : Hayakawa et al., 1984 ; 3 : Brick et al., 1985 ; 4 : Svoboda et al., 1986 ; 5 : Waschek et al., 1988 ; 6 : Agoston et al., 1992 ; 7 : Kimura et al., 1992 ; 8 : Adler et al., 1993 ; 9 : Ohsawa et al., 1985 ; 10 : Hahm et Eiden, 1999 ; 11 : Suzuki et al., 1994b ; 12 : Waschek et al., 1989 ; 13 : Waschek et al., 1997 ; 14 : Pence et Shorter, 1992 ; 15 : Georg et al., 1994 ; 16 : Hashemi et al., 2003 ; 17 : Lutz et al., 2006 ; 18 : Symes et al., 1993 ; 19 : Rao et al., 1992 ; 20 : Symes et al., 2000 ; 21 : Pitts et al., 2001 ; 22 : Kristensen et al., 1997 ; 23 : Georg et Fahrenkrug, 2000 ; 24 : Pence et Shorter, 1993.
différenciation (Pence et Shorter, 1992). Cependant, dans la lignée NB-1, l’acide rétinoïque stimule l’expression du VIP, sans induire de différenciation morphologique (Georg et al., 1994).
Un phénomène comparable est observé dans les cellules NBFL, dans laquelle un traitement par la cytokine CNTF stimule l’expression du VIP sans induire de changements morphologiques (Symes et al., 1993). Dans cette lignée, les cytokines LIF et oncostatine-M augmentent également l’expression de l’ARNm VIP (Rao et al., 1992). Certains membres de la famille du TGF-ß (transforming growth factor ß), comme le TGF-ß lui-même et l’activine, stimulent l’expression du VIP et peuvent agir en synergie avec le CNTF pour augmenter la transcription du VIP (Symes et al., 2000 ; Pitts et al., 2001).
La carbamylcholine, un analogue de l’acétylcholine, induit une augmentation de l’expression de l’ARNm et du peptide VIP dans les lignées de neuroblastome NB-1 et BE(2)M17. Cependant cela n’est pas associé à une différenciation morphologique (Kristensen et al., 1997). Dans la lignée SH-SY5Y, l’expression du VIP induite par la carbamylcholine n’est pas associée à une augmentation de l’ARNm du précurseur de ce peptide, et serait plutôt liée à des événements traductionnels ou post-traductionnels (Agoston et al., 1992).
L’expression du VIP peut également être régulée par le VIP lui-même ou le PACAP. Dans la lignée NB-1, le PACAP stimule l’expression de l’ARNm et du peptide VIP (Georg et Fahrenkrug, 2000). Le VIP stimule l’expression du PACAP dans les cellules IMR-32, cependant, cet effet est 100 fois plus faible que celui du PACAP, qui induit sa propre expression dans cette lignée (Suzuki et al., 1994b). Dans les cellules LA-N-5, le VIP induit une différenciation morphologique ainsi que l’augmentation de l’expression du VIP et de ses récepteurs fonctionnels (Pence et Shorter, 1993). Ainsi, le VIP, comme l’acide rétinoïque, peut réguler l’expression des différents composants du système autocrine ou paracrine VIP-récepteurs.
Tous ces agents, qu’ils induisent ou non la différenciation morphologique, augmentent l’expression du VIP et, quand cela a été analysé, augmentent le nombre de sites de liaison du VIP dans les cellules de neuroblastome.
3) Signalisation intracellulaire associée au système VIP-récepteur dans les cellules de neuroblastome
De nombreuses voies de signalisation sont induites par les neuropeptides de la famille du VIP dans des lignées de neuroblastome (Tableau IX).
Neuropeptide Eléments de signalisation Lignées Références
AMPc SK-N-SH, N1E-115 1, 2
Ca2+, CaM SK-N-SH 3, 4
PKA, IP3, Ca2+ SH-SY5Y 5
Ras / Erk, Cdc42 SH-SY5Y 6 VIP
AMPc / PKA Neuro2A 7
PKA, IP3, Ca2+ SH-SY5Y 5
AMPc, MAPK SH-SY5Y 8, 9
AMPc, Ca2+ N1E-115 10
MAPK (< nM) Neuro2A 7 AMPc / PKA (> nM) Neuro2A 7 PACAP
PHI MAPK Neuro2A 7
Tableau IX : Principales voies de signalisation induite par les neuropeptides de la famille du VIP dans les cellules de neuroblastomes.
1 : Muller et al., 1989 ; 2 : Inukai et al., 1994 ; 3 : Oettling et al., 1990 ; 4 : Mangels et Gnegy, 1992 ; 5 : Wojcikiewicz et Luo, 1998 ; 6 : Alleaume et al., 2004 ; 7 : Lelièvre et al., 1998 ; 8 : Lutz et al., 2006 ; 9 : Monaghan et al., 2008 ; 10 : Chik et al., 1996.
Dans la lignée de neuroblastome humain SK-N-SH, le VIP stimule la production d’AMPc, avec un ordre d’efficacité dans les trois clones issus de cette lignée qui est le suivant : SH-EP > SH-SY5Y > SHIN (Muller et al., 1989). Les effets du VIP sont observés à des concentrations aussi faibles que 1 nM, avec une concentration en VIP induisant 50% de la réponse maximale (EC50) supérieure à 30 nM dans ces trois clones. Il a été montré que dans
les cellules SK-N-SH, le VIP augmente également la concentration cytoplasmique en Ca2+ (Oettling et al., 1990), ce qui induit la translocation de la calmoduline (CaM) de la membrane au cytoplasme (Mangels et Gnegy, 1992). Le rôle de la relocalisation de la CaM reste à élucider. Cependant, cette translocation pourrait induire l’interaction de la CaM avec des protéines de liaison, permettant ainsi la modulation d’enzymes dépendantes de la CaM et le contrôle du remodelage du cytosquelette. Dans la lignée SH-SY5Y, le VIP et le PACAP stimulent la phosphorylation du récepteur à l’IP3 de type 1 (Wojcikiewicz et Luo, 1998). Cette phosphorylation dépendante de la PKA stimule la mobilisation du Ca2+ induite par l’IP3, ce qui conduit ainsi à une augmentation de la concentration intracellulaire en Ca2+. Il apparaît donc que les neuropeptides de la famille du VIP peuvent augmenter la concentration intracellulaire en Ca2+ via la voie AMPc/PKA.
Dans les cellules SH-SY5Y, le VIP induit un remodelage neuritique associé à l’apparition de varicosités le long des neurites et d’un réseau de neurites longs et ramifiés (Alleaume et al., 2004). La voie Ras/ERK, bien qu’activée par le VIP, n’est pas impliquée dans ce remodelage, contrairement à la GTPase Cdc42. En effet, Cdc42 est fortement activée par le VIP, alors que l’expression du mutant dominant négatif de Cdc42 dans des expériences de transfection empêche les modifications neuritiques induites par le VIP. Ces données suggèrent que Cdc42 joue un rôle clé dans le remodelage neuritique induit par le VIP, et constituent ainsi la première preuve de la régulation de l’activité d’une GTPase de la famille Rho par le VIP dans les cellules de neuroblastome.
Dans cette même lignée, le PACAP induit la différenciation morphologique via les récepteurs PAC1. Cet effet est dépendant de l’AC et de l’AMPc. En effet, l’augmentation du taux d’AMPc conduit à l’activation de la voie des MAPK par l’intermédiaire d’un mécanisme indépendant de la PKA mais qui pourrait impliquer l’Epac (protéine échangeuse directement
activée par l'AMPc) qui semble induire l’activation de Erk (Lutz et al., 2006 ; Monaghan et al., 2008).
Dans les cellules de neuroblastome murin N1E-115 et Neuro2a, le VIP et le PACAP stimulent la production d’AMPc (Inukai et al., 1994 ; Chik et al., 1996 ; Lelièvre et al., 1998), comme dans les cellules de neuroblastome humain. De plus, dans la lignée N1E-115, le PACAP augmente également la concentration intracellulaire en Ca2+ (Inukai et al., 1994 ; Chik et al., 1996). Dans cette même lignée, les effets du VIP et du PACAP sur la production d’AMPc peuvent être augmentés par le Ca2+ intracellulaire. Cette potentialisation pourrait résulter de l’activation d’adénylyl cyclases dépendantes du Ca2+. Inversement, l’activation de protéines kinases de type PKC par les esters de phorbol diminue la réponse AMPc induite par le VIP et le PACAP, peut-être à cause de la phosphorylation des récepteurs des neuropeptides par les PKC. De manière intéressante, l’atténuation de la réponse à ces peptides peut également résulter de l’inhibition d’isoformes distinctes d’AC par une nouvelle PKC (nPKC).
Les voies de signalisation associées au contrôle de la prolifération par le VIP, le PACAP et le PHI ont été étudiées dans la lignée murine Neuro2a (Lelièvre et al., 1998). Ces trois peptides ont des effets différents sur la prolifération de ces cellules et agissent via différentes voies de signalisation. Le VIP et le PHM inhibent la croissance cellulaire. Le VIP agit via la voie AMPc/PKA, alors que l’effet du PHM est dépendant des MAPK. Le PACAP a des effets biphasiques dépendant de la dose : à des concentrations subnanomolaires, le PACAP stimule la prolifération via les MAPK, alors qu’à des concentrations plus élevées, ce même peptide inhibe la croissance cellulaire selon un mécanisme dépendant de la voie AMPc/PKA.
Ainsi, les voies de signalisation induites par les neuropeptides de la famille du VIP dans les cellules de neuroblastome sont nombreuses et complexes. En plus des seconds messagers « classiques » (AMPc, Ca2+), il apparaît que les effets des neuropeptides dans les cellules de
neuroblastome sont médiés par des voies moins connues, impliquant par exemple la GTPase Cdc42 ou l’Epac.
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