Régulation de l’activité d’AtMYB30

Comme nous l’avons vu dans le chapitre précédent, l’activité des facteurs MYB est contrôlée finement par des mécanismes de régulation tels que des modifications post-traductionnelles intramoléculaires ou par l’association en complexes activateurs ou répresseurs. Etant donnée que l’expression constitutive d’AtMYB30 ne cause pas de mort cellulaire constitutive (phénotype « lésions- spontanées »), il est donc tentant de supposer que l’effet d’AtMYB30 est lui aussi soumis à une activation par des partenaires protéiques. Ceux-ci présents en quantités limitantes dans les plantes AtMYB30ox rendraient impossible la mise en place d’une HR spontanée. De plus, il est crucial pour la survie de la plante de réguler, de façon appropriée, un activateur de la mort cellulaire tel qu’AtMYB30. Des modifications post-traductionnelles pourraient jouer ce rôle via sa stabilisation ou sa dégradation dans la

INTRODUCTION Chapitre V : AtMYB30, un régulateur positif de la HR

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cellule, la régulation de son activité transcriptionnelle ou sa conformation, lui permettant de participer à des complexes.

1.3.1 Les modifications post-traductionnelles d’AtMYB30

Les facteurs de transcription peuvent être la cible de modifications intramoléculaires comme la phosphorylation, la sumoylation ou l’ubiquitination. Des données récentes indiquent qu’AtMYB30 serait la cible de modifications post-traductionnelles. En effet, l’analyse de la mobilité électrophorétique sur gel SDS-PAGE d’une version taguée d’AtMYB30-TAP révèle une bande majeure correspondant à la taille attendue prédite par sa séquence (57kDa) et plusieurs bandes minoritaires d’un poids moléculaire plus élevé commençant autour de ~70 kDa, ce qui suggère la présence de résidus associés à AtMYB30 tels que SUMO ou ubiquitine (Rivas S., données non publiées).

En faveur de cette hypothèse, il a été montré qu’AtMYB30 est cible de SUMOylation in planta et les résidus lysine qui sont SUMOylés ont été caractérisés par LC-MS/MS (Okada et al., 2009). De plus, plusieurs versions d’AtMYB30, mutées dans un ou plusieurs résidus lysine ont été générées (Chauveau C. et Rivas S.). Certaines de ces mutations exercent un effet négatif sur l’activité transcriptionnelle d’AtMYB30. Enfin, un certain nombre de données récentes acquises au laboratoire laissent penser qu’AtMYB30 serait la cible de l’effecteur bactérien XopD de Xcc. XopD a une activité SUMO protéase et semble être capable de réprimer la transcription de certains gènes de plante afin de contourner la mise en place de la défense (Kim et al., 2008). Des essais de transactivation ont montré que XopD était capable de réprimer l’activité transcriptionnelle d’AtMYB30, et d’interagir avec celui-ci (Cannone J., données non publiées).

Par ailleurs la phosphorylation in vivo d’AtMYB30 a été montrée, mais la signification biologique de cette modification, et la nature de la (des) kinase(s) impliquée(s) sont à ce jour inconnues (Rivas S.).

1.3.2 Recherche de partenaires protéiques d’AtMYB30

Cet axe de recherche a été développé et est toujours en cours par différentes stratégies mises en œuvre par plusieurs membres de l’équipe (Xavier Daniel, Susana Rivas et Solène Froidure). Un crible double hybride chez la levure a d’abord été réalisé et a permis d’identifier sans a priori des interacteurs d’AtMYB30 (Daniel X.). L’étude de deux de ces interacteurs a été privilégiée :

- une phospholipase sécrétée AtPLA2, dont l’interaction in planta a été montrée par FLIM

(Fluorescence Lifetime Imaging) dans le noyau. De façon intéressante, la protéine cytoplasmique humaine cPLA2, relocalisée dans le noyau après son interaction avec le TF B-Myb, est connue pour réguler l’activité de ce TF (Tashiro et al., 2004).

- Une protéine RING à doigt de zinc (C3H2C3-type RING finger) renommée MIP1 (AtMYB30- Interacting Protein 1) est prédite pour avoir une activité ubiquitine E3 ligase, qui pourrait être impliquée dans l’ubiquitination in planta d’AtMYB30.

1.3.3 AtMYB96, un autre partenaire d’AtMYB30 ?

Au cours de travaux antérieurs (Raffaele, 2006), l’analyse comparative du phénotype des plantes

AtMYB30ko et AtMYB30as a conduit à penser qu’un autre facteur MYB pouvait participer à la mise en

hpi Xcc147

avirulent

AtMYB30ox

AtMYB30as

Figure 50 : Représentation schématique de la stratégie expérimentale choisie pour rechercher des cibles putatives d’AtMYB30 (Raffaele et al., 2008).

Les 3 lignées d’Arabidopsis (sauvage, AtMYB30ox et AtMYB30as) ont été inoculées par la souche avirulente 147 d’Xcc. Des feuilles ont été récoltées avant l’inoculation puis au cours d’une cinétique après l’inoculation, et les ARNs extraits de ces tissus. Cette récolte d’échantillons a été réalisée sur deux expériences biologiques indépendantes. Les hybridations ont été réalisées sur les puces ATH1 d’Affymetrix permettant d’analyser l’expression de plus de 22000 gènes.

Tableau 8 : Liste des 18 gènes cibles identifiés par analyse transcriptomique (Raffaele et al., 2008)

La dernière colonne montre le taux d’induction à partir des niveaux d’expression moyens sur 2 expériences indépendantes dans la plante sauvage inoculée en comparaison à la plante sauvage non inoculée (WT1/WT0) et dans la lignée AtMYB30ox comparée à la plante sauvage (Ox/WT) après inoculation avec la souche Xcc147.

1,8 2,4

PAS2 (tyrosine phosphatase-like protein) AT5G10480 250428_at 2,1 1,4 protéine inconnue AT5G55620 248028_at 2,9 2,3 protéine inconnue AT1G35180 245783_s_a Inconnues 2,8 1,9 mannitol dehydrogenase AT4G39330 252943_at 2,2 1,9

integral membrane protein AT4G25830

254041_at Autres fonctions

2,1 2,2

WAX2/CER3 (aldehyde decarbonylase) AT5G57800 247884_at 2,5 9,0 PPT1 (palmitoyl thioesterase) AT5G47330 248812_at 3,9 3,7

CER2 (fatty acids elongation) AT4G24510 254122_at 2,3 2,6 HCD1 (enoyl-CoA hydratase/isomerase ) AT4G14440 245612_at 1,5 2,4

ATT1 (cytochrome P450 CYP86A2) AT4G00360

255690_at

2,9 3,3

CER10 (enoyl-CoA reductase) AT3G55360

251796_at

1,5 2,3

LTP2 (nonspecific lipid transfer protein 2) AT2G38530

266415_at

1,6 1,6

FDH (β-ketoacyl-CoA synthase - FIDDLEHEAD) AT2G26250

267377_at

1,7 1,5

GL8 (β-keto acyl reductase - GLOSSY8) AT1G67730

245199_at

1,6 2,3

Lipid transfer protein (GPI anchored) AT1G27950 259592_at 2,1 1,5 KCS2 (β-ketoacyl-CoA synthase 2) AT1G07720 261420_at 1,7 2,2

GPAT4 (Glycerol-3P acyl trasnferase) AT1G01610 259430_at 2,8 2,2 KCS1 (β-ketoacyl-CoA synthase 1) AT1G01120 261570_at

Métabolisme des lipides

Ox / WT

WT1/ WT0

Annotation TAIR Numéro

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AtMYB30as. Une recherche basée sur l’analyse des profils d’expression des gènes MYB au cours d’une

interaction pathogène, a permis d’identifier AtMYB96 comme pouvant être un régulateur agissant en coopération avec AtMYB30. Des données préliminaires indiquent que ce facteur MYB agit en effet comme un régulateur positif de la HR, tout comme AtMYB30.