Chapitre IV : Les facteurs de transcription de type MYB
4. Quelles cibles pour les facteurs MYB ?
La recherche des cibles directes est une question majeure pour l’étude du mode d’action d’un facteur de transcription. Alors qu’une recherche de séquences cis présentes sur les promoteurs peut s’avérer fructueuse pour l’identification de gènes cibles de TF tels que les ERF ou les WRKY (Eulgem, 2004; Singh et al., 2002), cette approche peut se révéler insuffisante dans la recherche de gènes cibles de facteurs MYB. En effet, comme nous l’avons évoqué précédemment, il n’y pas véritablement de séquences spécifiques de liaison des MYB à leurs promoteurs cibles. D’autres approches ont donc été réalisées et combinées, afin d’identifier des cibles de facteurs MYB.
Afin d’identifier sans a priori les cibles d’un facteur de transcription, et plus particulièrement des facteurs MYB, une analyse transcriptomique par micro-array peut s’avérer fructueuse. Par exemple des gènes cibles de NtmybA2 ou de MYB118 ont pu être identifiés, par exemple les gènes LEA (Late Embryogenesis abundant) pour NtE2C impliqué dans la phase G2/M du cycle cellulaire (Kato et al., 2009; Zhang et al., 2009). Néanmoins, parmi les gènes identifiés par analyse transcriptomique, il est impossible de discriminer les gènes directement régulés de ceux qui le sont indirectement. C’est pourquoi des expériences de liaison à l’ADN complètent souvent ces analyses (simple hybride, gel retard).
De nombreuses cibles directes de facteurs MYB ont été identifiées par des approches sans a
priori, par exemple à l’aide de plantes transgéniques exprimant le facteur fusionné au récepteur
glucocorticoïde GR ou récepteur à œstrogène (HER) (Baudry et al., 2004; Spelt et al., 2000; Zhong et al., 2008; Zhou et al., 2009). La fusion avec le récepteur GR ou HER permet le contrôle de la localisation subcellulaire de la protéine chimérique en la retenant dans le cytoplasme. Le déxaméthasone (DEX) ou l’œstrogène, se liant au récepteur glucocorticoïde, permet la translocation de la protéine dans le noyau et l’activation des gènes cibles du facteur étudié (Schena et al., 1991). Un traitement avec le DEX et le cycloheximide (CHX), un inhibiteur de la synthèse protéique, permet d’identifier les cibles directes (ou tout du moins indépendantes de la synthèse protéique) du facteur. En effet, alors que les gènes SND2,
SND3, MYB103, MYB52, MYB54, KNAT7, MYB85 et MYB42 sont tous induits dans les lignées
surexprimant SND1 et dans les lignées traitées aux œstrogènes surexprimant SND1 fusionné au récepteur HER, seules les gènes SND3, MYB103 et KNAT7 sont induits dans les lignées SND1-HER traitées aux œstrogènes et au CHX, suggérant que les cibles directes de SND1 sont SND3, MYB103 et KNAT7 et que les autres gènes sont des cibles indirectes (Zhong et al., 2008).
Cependant les résultats obtenus par cette technique doivent être validés par des expériences in
vitro et/ou in vivo de liaison à l’ADN du TF sur le promoteur cible afin de s’assurer de la spécificité de la
cible. Par exemple, l’utilisation de lignées inductibles GR a permis d’identifier que le TF MYB WEREWOLF (WER) active directement la transcription du gène CAPRICE (CPC) au cours de la différenciation cellulaire dans l’épiderme des racines d’Arabidopsis (Ryu et al., 2005). Deux éléments cis,
Ces exemples laissent entrevoir la complexité de la régulation de l’activité des facteurs
MYB qui fonctionnent en réseaux, suggérant la mise en place de rétrocontrôles positif et
négatif soit au niveau transcriptionnel, soit au niveau post-traductionnel par la formation de
complexes protéiques. De plus comme dans le modèle animal, les modifications
intramoléculaires semblent jouer un rôle important dans la régulation des facteurs MYB
végétaux.
INTRODUCTION Chapitre IV : Les facteurs de transcription de type MYB
72
nommés WER-binding site (WBSI et WBSII) ont été identifiés dans le promoteur de CPC par gel retard et confirmé dans la levure par simple hybride (Ryu et al., 2005). De même, le gène BANYULS (BAN) a été identifié comme cible directe du complexe transcriptionnel TT2-TT8-TTG1, et validé par des expériences de trans-activation du promoteur de BAN fusionné au gène rapporteur GUS, par expression transitoire dans des protoplastes d’Arabidopsis (Baudry et al., 2004).
La méthode d’immunoprécipitation de chromatine (Chromatin ImmunoPrecipitation - ChIP) permet désormais l'étude des protéines interagissant avec la molécule d'ADN. Contrairement aux techniques d'étude des interactions protéines - ADN, l'ADN utilisé ici est directement récupéré in vivo ce qui a l’avantage d'avoir une idée plus réaliste des processus à l'œuvre dans les cellules lors de l'initiation de la transcription. Cette méthodologie consiste à réaliser une liaison covalente in vivo des protéines à l'ADN, en général par l'utilisation de formaldéhyde. L’ADN est ensuite extrait, découpé, sélectionné à l’aide d’un anticorps spécifique du TF d’intérêt, puis les complexes ADN-protéine-anticorps sont précipités. Enfin, le complexe ADN-protéine est dissocié afin de ne garder que l'ADN. Une Q-RT-PCR est alors réalisée pour identifier des sites de fixation de facteurs de transcription connus et vérifier leur présence ou leur absence. Cette méthode a permis d’identifier des régulateurs de gènes MYB comme
MYB46 qui est une cible directe de SND1 ou MYB30 qui est une cible directe de BES1 (bri1-
Ethylmethane Sulphonate suppressor 1) impliqué dans la réponse aux stéroïdes (Li et al., 2009; Zhong et
al., 2007). La méthode ChIP peut être suivie d’une analyse sans a priori (i) avec une puce à ADN (ChiP-
chip) ou (ii) avec un séquenceur haut débit (ChiP-Seq) permettant d’identifier les sites de fixation du TF (Massie and Mills, 2008). L’analyse par ChIP s’avèrent un outil puissant, les gènes cibles de AGAMOUS-Like 15, protéine à domaine MADS, ou du bHLH PIL5, ont ainsi pu être identifiés sur l’ensemble du génome d’Arabidopsis (Oh et al., 2009; Zheng et al., 2009).
Les gènes MYB de type R2R3 forment une famille multigénique de grande taille
chez Arabidopsis, présentant de fortes homologies avec les MYB des vertébrés. Leur domaine
MYB de liaison à l’ADN est très conservé, alors que leur partie C-terminale est plus variable.
De plus il semble que la régulation de l’activité des facteurs MYB soit extrêmement complexe
faisant intervenir en combinaison des modifications post-traductionnelles variées et des
interactions protéine-protéine.
AtMYB30, identifié antérieurement, a constitué l’un des tout premiers cas de l
facteurs MYB végétaux impliqués dans la réponse aux agents pathogènes. L’analyse
fonctionnelle qui a suivi son isolement a en effet démontré son rôle dans la mise en place de la
HR en réponse à divers agents pathogènes (chapitre V).
Figure 47 : Stratégie de clonage des gènes hsr
(D’après Lacomme et Roby, 1999)
Figure 48 : Analyse par RT-PCR de l’expression d’AtMYB30 en réponse à la souche Xcc147 (D’après
Daniel et al., 1999)
A. Expression d’AtMYB30 dans l’écotype résistant Col-0 en réponse à une inoculation avec l’eau et avec la souche Xcc147.
B. Expression d’AtMYB30 dans l’écotype sensible Sf-2 en réponse à une inoculation avec l’eau et avec la souche Xcc147.
Clones Locus Annotation TAIR Athsr1 (1clone) At3g28910 Facteur de transcription de type MYB Athsr2 (16clones) At5g15090
Porin VDAC (Voltage- dependant-anion-selective-
channel protein) Athsr3
(6clones) At3g22370 AOX1, oxydase Athsr4
(1clone) At3g50930 AAA-type ATPase Athsr5
(1clones At5g63970 copine related Athsr6 (1clone) At2g02180 TOM3 tobamovirus multiplication protéine Athsr7 (1clone) At3g14990 4-methyl-5(b-hydroxyethyl)- thiazole monophosphate biosynthesis Cellules d’Arabidopsis en culture
Traitement au cycloheximide Incubation avec l’isolat 8B2 d’Xcc (souche hrp-) ARN polyA Sonde CHX-HR- Sonde HR- Incubation avec l’isolat 147 d’Xcc ARN polyA Sonde CHX-HR+ Sonde HR+ Banque d’ADNc Crible différentiel
Clones ADNc Athsr
A B C 15’ 30’ 45’ 60’ 75’ 90’ 2h 8h 24h C 15’ 30’ 45’ 60’ 75’ 90’ 2h 8h 24h C 15’ 30’ 45’ 60’ 75’C 15’ 30’ 45’ 60’ 75’ 90’ 2h 90’ 2h 8h 24h8h 24h C 15’ 30’ 45’ 60’ 75’ 90’ 2h 8h 24h C 15’ 30’ 45’ 60’ 75’ 90’ 2h 8h 24h C 15’ 30’ 45’ 60’ 75’C 15’ 30’ 45’ 60’ 75’ 90’ 2h 90’ 2h 8h 24h8h 24h C 15’ 30’ 45’ 60’ 75’ 90’ 2h 8h 24h C 15’ 30’ 45’ 60’ 75’ 90’ 2h 8h 24h C 15’ 30’ 45’ 60’ 75’C 15’ 30’ 45’ 60’ 75’ 90’ 2h 90’ 2h 8h 24h8h 24h C 15’ 30’ 45’ 60’ 75’ 90’ 2h 8h 24h C 15’ 30’ 45’ 60’ 75’ 90’ 2h 8h 24h C 15’ 30’ 45’ 60’ 75’C 15’ 30’ 45’ 60’ 75’ 90’ 2h 90’ 2h 8h 24h8h 24h AtMYB30 -Tubuline Col-0 H2O Xcc147 H2O Xcc147 AtMYB30 -Tubuline Sf-2
INTRODUCTION Chapitre V : AtMYB30, un régulateur positif de la HR
73