Le récepteur β 2 Adrénergique

Régie sous l’action des catécholamines regroupant l’adrénaline (épinéphrine) et la noradrénaline (norépinéphrine), la famille des récepteurs β-adrénergiques est formée par les isoformes β1, β2 et β3. Lorsque sécrétée par le système nerveux central, l’adrénaline agit à

titre de neurotransmetteur et agit également en tant qu’hormone lorsqu’elle est libérée dans la circulation sanguine par les glandes surrénales (Davis et al., 2008). Cette dernière est sécrétée en réponse à un état de stress, entraînant habituellement une augmentation du rythme et de la force des contractions cardiaques ainsi qu’une hausse de la pression artérielle (Davis et al., 2008). L’activation du récepteur β2AR par l’adrénaline est

principalement associée à des effets broncho- et vasodilatateurs (Barnes et al., 1983; Edvinsson and Owman, 1974). Dépendamment du système physiologique étudié, on remarque la grande distribution et l’étendue des fonctions de ce récepteur. Comme l’indique le tableau 7, on observe la présence de ce dernier dans les systèmes pulmonaire, cardiovasculaire, nerveux central et nerveux sympathique. Ses capacités dilatatrices sont fréquemment exploitées pour traiter les personnes atteintes d’asthme. En effet, l’inhalation d’agoniste synthétique provoquant l’activation du récepteur, crée une bronchodilation soulageant temporairement les symptômes de cette maladie. Plus de 49 polymorphismes du gène codant pour ce récepteur sont répertoriés chez des patients atteints d’asthme. Le plus fréquent de ces variants encode en 16e position un acide aminé glycine,au lieu d’un arginine (Ortega and Wechsler, 2013). Il a été démontré que ce SNP (single nucleotide polymorphism) ne change aucunement l’affinité de l’agoniste envers le récepteur de type sauvage (Arg16) ou muté (Gly16). Toutefois, une stimulation prolongée (24 h) du récepteur muté réduit significativement le niveau d’expression de surface de ce récepteur comparativement à celui de type sauvage (Green et al., 1995; Green et al., 1994; Ortega and Wechsler, 2013). De plus, le trafic intracellulaire altéré du récepteur mutant, β2AR-Gly16,

fut démontré pour corréler avec une diminution d’efficacité des traitements employant des β-agonistes chez certains patients homozygotes Gly16. Cette observation laisse donc place à l’élaboration de médicaments dirigés vers de nouvelles cibles thérapeutiques pouvant

43 mieux traiter ce type de patients (Cho et al., 2005; Choudhry et al., 2005; Lima et al., 1999).

Au niveau cardiaque, l’activation des récepteurs β1AR et β2ARprovoque un effet ino- et

chronotropique positif, soit une augmentation de la force de la contraction musculaire et du rythme cardiaque. Ces effets sont attribués à l’activation de la protéine Gαs et à la production d’AMPc résultant en l’activation de voie de signalisation augmentant la transcription de gènes ou l’activité de protéines contrôlant le rythme et la contraction/relaxation cardiaques (Woo and Xiao, 2012). En conditions d’insuffisance cardiaque, notre organisme est exposé à une quantité élevée et continue de catécholamines activant ainsi perpétuellement ces récepteurs. On augmente donc ainsi la charge du travail cardiaque qui à long terme cause l’apoptose des myocytes et un mauvais remodelage des Tableau 7: Distribution et fonctions des récepteurs β-Adrénergiques (Adapté de Davis et al., 2008).

44 fonctions cardiaques pouvant mener ultimement à de graves complications et même au décès. Contrairement au récepteur β1AR, en condition d’activation prolongée, le récepteur

β2AR se couple à la protéine Gαi et inhibe la signalisation faite par la Gαs. Cette

caractéristique confère donc des propriétés cardioprotectrices à ce récepteur, puisque l’activation de la protéine Gαi antagonise les effets de la Gαs en inhibant l’activité de l’adénylate cyclase (AC) et donc la production d’AMPc et l’activation des voies de signalisations subséquentes. De plus, la Gαi et les sous-unités Gβγ sont également impliquées dans l’activation de la PI3K qui elle est associée au processus de survie cellulaire (Figure 24). L’utilisation de β-bloqueurs (β-antagonistes) est un des traitements fréquents pour contrecarrer les conséquences reliées à cette pathologie. Toutefois, leurs utilisations ont une efficacité limitée chez certains patients et provoquent dans certains cas des effets secondaires (Woo and Xiao, 2012). C'est pourquoi le développement de nouvelles stratégies pour améliorer cette situation est important. L’un des traitements potentiels est de tirer profit des capacités cardioprotectrices du récepteur β2AR (Perez-

Schindler et al., 2013). Toutefois, cette stratégie requiert une meilleure compréhension des

Figure 24: Principales voies de signalisation activées par les récepteurs β1AR et β2AR. La stimulation des deux récepteurs peut induire la voie de signalisation Gαs/Adenylate Cyclase (AC)/AMPc/PKA. Cependant, le récepteur β2AR régule une voie de signalisation alternative via la protéine Gαi et l’hétérodimère Gβγ se répercutant en l’inhibition de l’AC et l’activation de la voie PI3K. Conséquemment, l’activation des récepteurs β1AR et β2AR module différemment la contraction, la survie et le métabolisme du cœur (Tiré de Perez-Schindler et al., 2013).

45 voies de signalisation reliées à ce récepteur et le développement de drogues hautement sélectives pour ce dernier.

Pour terminer, il est important de mentionner que de plus en plus d’études répertorient l’implication du récepteur β2AR dans certains cancers, la maladie d’Alzheimer et les

maladies osseuses (Bonnet et al., 2008; Cole and Sood, 2012; Yu et al., 2011a). En effet, il fut démontré que l’utilisation de β-bloqueurs diminuerait la progression de certains types de tumeurs (cancer de la prostate et du sein majoritairement) (Melhem-Bertrandt et al., 2011; Palm et al., 2006; Powe et al., 2010), en plus de ralentir la progression de la maladie d’Alzheimer et d’augmenter la masse osseuse (Bonnet et al., 2008; Yu et al., 2011 b). Par l’ensemble de ces observations, nous sommes forcés de constater l’ampleur des fonctions physiologiques de ce récepteur. C’est pourquoi, il est nécessaire de continuer d’étudier et d’éclaircir les voies de signalisations empruntées par ce dernier, même s’il est un, pour ne par dire le plus étudié des GPCRs.

3.2. La protéine Rab11a

Pour sa part, la protéine Rab11a est la plus étudiée des membres inclus dans la sous- famille Rab11 qui comprend également les protéines Rab11b et Rab25 (parfois nommée Rab11c). Cette dernière est exprimée de façon ubiquitaire et reconnue pour contrôler le trafic vésiculaire des endosomes de recyclage tardifs vers le TGN (Trans Golgi Network) en plus du transport du TGN vers la membrane cellulaire. Ainsi, Rab11a joue directement un rôle sur l’expression de surface des protéines qu’elle transporte. Depuis sa découverte, Rab11a fut identifiée entre autre pour être impliquée dans les processus de division cellulaire, de phagocytose et de migration cellulaire (Kelly et al., 2012b). En effet, son association avec les protéines Evi5 et TBC1D14 fut démontrée nécessaire au processus de clivage des membranes lors de la division cellulaire ainsi qu’à la formation des autophagosomes (Horgan and McCaffrey, 2012; Longatti et al., 2012). Même si aucune GEF n’est actuellement identifiée, plusieurs partenaires d’interaction ainsi que plusieurs effecteurs activés par Rab11a sont bien connus (Tableau 8). Parmi ces effecteurs, la famille des Rab11-FIPs (Rab11-Family Interacting Proteins) est la plus importante. Des études démontrent qu’une surexpression de certaines de ces protéines (FIP1C et FIP3) corrèle avec

46 l’augmentation de la migration des cellules cancéreuses développées lors du cancer du sein (Caswell et al., 2008; Jing et al., 2009; Zhang et al., 2009). De plus, le rôle de Rab11a dans ce phénomène fut également répertorié, et ce pour le même type de cancer. En effet, il fut démontré qu’en condition d’hypoxie le trafic intracellulaire fait par Rab11a était induit ce qui favorise la migration cellulaire des cellules cancéreuses en augmentant la présence à la surface cellulaire des intégrines α4β6 (Yoon et al., 2005). Outre le cancer du sein, l’implication de Rab11a dans la maladie d’Alzheimer est pareillement soulevée. En premier lieu, une étude rapporte l’interaction de cette dernière avec les protéines présenilines (PS), PS1 et PS2, dont la mutation est un des faits proéminents reliés au développement de cette Tableau 8: Partenaires d’interaction de Rab11a (Adapté de Kelly et al., 2012 b)

47 pathologie (Dumanchin et al., 1999). En second lieu, une étude révèle que l’estrogène réduit la sécrétion de fibres β-amyloïdes (βA) en stimulant le recrutement de Rab11a aux membranes du TGN. Ceci signifie ainsi que l’activation du trafic vésiculaire fait par Rab11a serait impliquée dans ce processus (Greenfield et al., 2002). Toutefois, la relation entre l’interaction de Rab11a avec les PSs et son influence dans la production de fibres βA reste à élucider. Outre son implication dans le cancer et les maladies neurodégénératives, l’action de Rab11a dans le développement de l’influenza A est également démontré. En effet, il est reconnu que certains pathogènes et virus s’approprient certaines voies du trafic intracellulaire et leur machinerie afin de faciliter leur réplication au sein de leur hôte. Dans le cas de l’influenza A, il fut démontré que Rab11a ainsi que son effecteur FIP3 sont nécessaire au bourgeonnement des particules virales et à la formation de virions filamenteux (Bruce et al., 2010). L’ensemble de ces évidences souligne l’importance du trafic vésiculaire fait par Rab11a et la nécessité d’élucider les mécanismes moléculaires modulant sa localisation et son activation.

4. Problématique et Hypothèse

Depuis plusieurs années, de nombreux laboratoires s’intéressent aux mécanismes pouvant contrôler les processus de transport antérograde et rétrograde des GPCRs. Sachant qu’environ 30 % des médicaments ciblent de façon directe et indirecte ces récepteurs, une compréhension plus détaillée des mécanismes les régulant est essentielle pour que l’on puisse élaborer et/ou améliorer l’efficacité et la spécificité de ces drogues (Hopkins and Groom, 2002). Plusieurs études évoquées au cours de l’introduction décrivent l’importance des Rabs dans le routage intracellulaire des GPCRs. En plus, ces protéines, tout comme les GPCRs, sont des cibles très reconnues de diverses pathologies humaines telles que le cancer et les maladies neurodégénératives. Conséquemment, l’élucidation des mécanismes de régulation des Rabs et de leurs protéines accessoires contribuant à des pathologies organes-spécifiques ou systémiques est un domaine de recherche important, constituant une base essentielle au trafic efficace des cibles thérapeutiques, comme les GPCRs, vers leur lieu d’opération (Li, 2011). Certaines équipes de recherche ainsi que notre laboratoire proposent qu’une interaction directe entre une Rab GTPase et un GPCR ferait en sorte que le récepteur pourrait lui-même contrôler son routage intracellulaire en régulant l’activité de

48 cette GTPase (Smythe, 2002). Toutefois, très peu d’études démontrent réellement le contrôle qu’exerce le GPCR sur l’activité de la GTPase, ce qui laisse place à l’investigation des mécanismes moléculaires impliqués dans ce phénomène (Seachrist et al., 2002).

4.1. Objectifs

Dans le but de tester notre hypothèse de recherche, deux objectifs furent élaborés non seulement en fonction de résultats obtenus antérieurement au laboratoire, mais également en se basant fortement sur la littérature touchant les processus d’activation des petites GTPases et le contrôle des GPCRs exercé sur ces dernières.

4.1.1. Objectif 1

Suite à l’analyse par immunobuvardage de différents extraits protéiques, Rab11a/pcDNA3 versus Rab11a/β2AR, on observait que la co-expression du récepteur

changeait le patron de migration de la GTPase, ce qui nous laissait croire que le récepteur β2AR modulait la maturation de la protéine Rab11a.Connaissant l’importance du motif –

CAAX et l’implication de la RGGT dans la maturation des Rab GTPases, nous avons donc entrepris d’élucider le rôle du récepteur β2AR dans le processus de maturation de la

protéine Rab11a.

4.1.2. Objectif 2

Sachant que la famille des Rab GTPases représente la plus grande classe de Ras GTPases et que très peu de Rab GEFs sont présentement identifiées, nous sommes restés à l’affût des études touchant de près et de loin cette famille de protéines (Marat et al., 2011). La parution d’études démontrant le rôle de l’ubiquitination dans l’activation des Ras GTPases et celle identifiant la E3-ubiquitine ligase, HACE1, comme partenaire d’interaction de la protéine Rab11, nous poussèrent à vérifier l’implication possible de cette modification post-traductionnelle dans l’activation de cette GTPase en plus de déterminer le rôle potentiel du récepteur β2ARdans ce phénomène (Baker et al., 2013; Sasaki et al.,

49

ARTICLE 1

REGULATION OF β2-ADRENERGIC RECEPTOR MATURATION AND ANTEROGRADE

TRAFFICKING BY AN INTERACTION WITH RAB GERANYLGERANYLTRANSFERASE:

MODULATION OF RAB GERANYLGERANYLATION BY THE RECEPTOR

Auteurs de l’article :

Véronik Lachance, Andréane Cartier, Samuel Génier, Sandra Munger, Pascale Germain, Pascale Labrecque, and Jean-Luc Parent

Statut de l’article :

The Journal of Biological Chemistry, vol. 286, no. 47, pp. 40802–40813, Nov. 25, 2011

Avant-propos :

Pour cet article, j’ai élaboré et réalisé la majorité des expérimentations. Les essais de co-immunoprécipitation faits entre le récepteur β2AR et les protéines Rab6a, Rab8a et

Rab11a ont été accomplis en collaboration avec mon stagiaire de l’époque, M. Samuel Génier et notre assistante de recherche, Mme Pascale Germain. Les essais de GST-Pull down ainsi que les clonages s’y associant ont été effectués en collaboration avec ma toute première stagiaire, Mlle Sandra Munger. La microscopie fut exécutée par ma collègue Andréane Cartier. Même si non mentionnée dans l’article, la RGGTA fut identifiée grâce à un criblage double hybride fait par notre seconde assistante de recherche, Mme Pascale Labrecque. J’ai effectué le montage de toutes les figures et la rédaction du manuscrit fut faite en collaboration avec mon directeur de recherche.

50 RÉSUMÉ

Notre laboratoire ainsi que plusieurs autres ont montré précédemment que les GPCRs interagissent directement avec les Rab GTPases. Dans la présente étude, nous démontrons que le récepteur β2-Adrénergique (β2AR) s’associe avec la sous-unité alpha de la Rab géranylgéranyltransférase (RGGTA). Des analyses faites par microscopie confocale illustrent que le récepteur β2AR co-localise avec la RGGTA au niveau de compartiments intracellulaires ainsi qu’à la membrane plasmique. En employant la mutagénèse dirigée, nous avons déterminé que la RGGTA lie les résidus L339L340 présents au sein de la queue C-terminale du récepteur 2AR, résidus reconnus pour leur implication dans le transport du récepteur provenant du RE vers la surface cellulaire. La surexpression ou l’inhibition par ARN interférents de la RGGTA nous démontra que cette dernière joue un rôle positif non seulement dans la maturation, mais également dans le transport antérograde du récepteur 2AR, lequel nécessite l’interaction de la RGGTA avec les résidus L339L340 du GPCR. De plus, nous montrons que le récepteur 2AR module spécifiquement la géranylgéranylation des protéines Rab6a, Rab8a et Rab11a, et non celle des autres Rab GTPases mises à l’essai dans cette étude. Cette géranylgéranylation est dépendante de l’interaction entre la RGGTA et les résidus L339L340. De plus, on montra que le mutant RGGTA- Y107F était incapable de moduler la géranylgéranylation des Rab GTPases. Ce dernier reste toutefois capable de promouvoir la maturation du récepteur 2AR, suggérant ainsi que la RGGTA posséderait des fonctions autres que la géranylgéranylation des Rabs. Finalement, notre étude démontre pour la première fois l’association entre un récepteur membranaire et la RGGTA, laquelle régule la maturation et le transport antérograde du récepteur, ainsi que la géranylgéranylation de Rab GTPases.

51 SUMMARY

Previous reports by us and others demonstrated that G protein-coupled receptors interact functionally with Rab GTPases. Herein, we show that the 2-adrenergic receptor (2AR) interacts with the Rab geranylgeranyltransferase -subunit (RGGTA). Confocal microscopy showed that 2AR co-localizes with RGGTA in intracellular compartments and at the plasma membrane. Site-directed mutagenesis revealed that RGGTA binds to the L339L340 motif in the 2AR C-terminus known to be involved in the transport of the receptor from the ER to the cell surface. Modulation of the cellular levels of RGGTA protein by overexpression or siRNA- mediated knockdown of the endogenous protein demonstrated that RGGTA has a positive role in the maturation and anterograde trafficking of the 2AR, which requires the interaction of RGGTA with the 2AR L339L340 motif. Furthermore, the 2AR modulates the geranylgeranylation of Rab6a, Rab8a, and Rab11a, but not of other Rab proteins tested in this study. Regulation of Rab geranylgeranylation by the2AR was dependent on the RGGTA-interacting L339L340 motif. Interestingly, a RGGTA-Y107F mutant was unable to regulate Rab geranylgeranylation but still promoted 2AR maturation, suggesting that RGGTA may have functions independent of Rab geranylgeranylation. We demonstrate for the first time an interaction between a transmembrane receptor and RGGTA which regulates the maturation and anterograde transport of the receptor, as well as geranylgeranylation of Rab GTPases.

52 INTRODUCTION

G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) form the largest family of cell surface proteins and are the major target of therapeutic drugs prescribed today. They mediate physiological responses to a vast array of cellular mediators such as hormones, neurotransmitters, lipids, nucleotides, peptides, ions, and photons. All GPCRs share a common molecular topology with a hydrophobic core of seven transmembrane-spanning α-helices, three intracellular loops, three extracellular loops, an extracellular N-terminus, and an intracellular C- terminus. GPCRs are typically delivered to the plasma membrane in a ligand-responsive and signalling competent form. Following agonist stimulation, the majority of GPCRs internalizes into endosomes and may then undergo recycling to the cell surface or lysosomal degradation (1-3).

Like for other membrane proteins, the synthesis and maturation of GPCRs require a complex combination of processes. Subsequent to a phase of folding, post-translational modifications, and quality control, proteins are exported from the endoplasmic reticulum (ER) in coated vesicles that assemble at ER exit sites. Rab GTPases are crucial regulators of intracellular vesicular trafficking. To cite a few, transport between the ER and Golgi complex is regulated by Rab1 and Rab2 which orchestrate specificity in fusion with membranes at the cis-Golgi (4-6). At the level of the Golgi complex, Rab6a regulates trafficking in both a retrograde (from early endosomes and Golgi to the ER) and an anterograde (from the Golgi to the plasma membrane) direction (7-13). Transport from the Golgi to the plasma membrane can follow several paths. One of these routes consists of exocytic vesicles delivery to the cell surface where they fuse with the plasma membrane, discharging their contents in the extracellular space and incorporating membrane-bound proteins in the plasma membrane. Rab8a and Rab11a were reported to be involved in trans- Golgi network to plasma membrane transport (14-18).

Post-translational modifications, specifically the addition of one or two prenyl groups to the C-terminus, proteolytic processing, and carboxymethylation, accompany the initial targeting of Rab GTPases to membranes (19,20). The transfer of a geranylgeranyl moiety from geranylgeranyl pyrophosphate to cysteines in Rab proteins with an -XXCC, -XCXC

53 and -CCXX carboxy-terminal is thought to be essential for membrane targeting. This is catalyzed by a specific Rab geranylgeranyltransferase (RGGT) that belongs to a family of protein prenyltransferases which includes farnesyltransferase and geranylgeranyltransferase I. All three enzymes are heterodimers consisting of one - and one -subunit (21).

Cargo-specific regulation of vesicular trafficking recently garnered much interest. Rab- mediated vesicular transport is well known to regulate membrane receptor trafficking, but less is known about whether membrane receptors conversely regulate the Rab trafficking machinery. We and others showed that G protein-coupled receptors (GPCRs) interact with Rabs resulting in the regulation of receptor trafficking (22-29). The task of unravelling whether membrane receptors interact with other elements of the Rab-associated machinery to direct their own trafficking remains. Here, we report a new mechanism that enables the 2-adrenergic receptor (2AR) to interact with RGGT to regulate the receptor anterograde trafficking and to modulate geranylgeranylation of specific Rab proteins.

54 EXPERIMENTAL PROCEDURES

Reagents-The monoclonal anti-HA (16B12), anti-c-Myc (9E10) and anti-GLU-GLU (anti-EE) antibodies were from Covance. The polyclonal anti-GST was from Bethyl Laboratories. The monoclonal anti-HA-HRP (3F10) was from Roche Applied Science. The anti-Myc-HRP polyclonal antibody was from Abcam. The monoclonal anti-RGGTB antibody was from Abnova whereas the polyclonal anti-RGGTA was from AVIVA Systems Biology. The anti-GAPDH polyclonal antibody and protein G-Agarose beads were purchased from SantaCruz Biotechnology. Alexa 546 goat anti-mouse, Alexa® 488 goat anti-rabbit and ProLong® Gold antifade reagent were purchased from Invitrogen. Isoproterenol, leupeptin, the monoclonal FLAGM1, the polyclonal FLAG, the rabbit anti-

Actin, the alkaline phosphatase-conjugated goat anti-mouse antibodies, and the alkaline phosphatase substrate kit were purchased from Sigma Aldrich. PNGase F and Endo Hf were from New England BioLabs.

Plasmid Constructs- The RGGTA (NCBI accession NM_182836) and RGGTB (NCBI accession NM_004582) cDNAs were amplified by PCR from a human Hela MATCHMAKER cDNA library (CLONTECH Laboratories). The RGGTA PCR fragment was digested with BamHI and EcoRI and ligated into the pcDNA3 and pRSETA vectors. The RGGTB PCR fragment was digested with KpnI and EcoRI, or XhoI and EcoRI, and